鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白增強抗體應(yīng)答的研究.pdf

1、一、研究背景
　　 鼠傷寒沙門氏菌是周毛菌，菌體周身遍布鞭毛，鞭毛是由基礎(chǔ)小體、鉤狀體和絲狀體三部分構(gòu)成，它不僅是沙門氏菌的運動器官，而且同時還具有特殊的抗原性，稱為H抗原，H抗原是沙門氏菌鑒定分型的重要依據(jù)，而且可以激發(fā)先天性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答。隨著對鞭毛主要成份——鞭毛蛋白免疫作用機理的不斷深入研究，逐漸發(fā)現(xiàn)沙門氏菌鞭毛蛋白可以通過自身激發(fā)先天性免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答，以啟動、增強特異性免疫系統(tǒng)對其他與鞭毛蛋白相連接的抗原產(chǎn)生特異性

2、的應(yīng)答，發(fā)揮較強的免疫佐劑作用，而且可以在粘膜表面誘導(dǎo)以Th2 型免疫反應(yīng)并且伴有IgA的分泌。其強大的免疫佐劑功效隨后在多種病原體疫苗的研究中獲得應(yīng)用，如應(yīng)用于鼠疫桿菌、變異鏈球菌、單核細胞增生李斯特菌、甲型流感病毒、西尼羅河病毒、和間日瘧原蟲等多種病原體的表位多肽和抗原蛋白，甚至用于增強甲型H1N1流感病毒滅活株的免疫應(yīng)答。而且在各項實驗中并沒有發(fā)現(xiàn)各種疫苗制劑因加入沙門氏菌鞭毛蛋白引起的過敏反應(yīng)或其他不良反應(yīng)，因此鞭毛蛋白作為疫苗

3、佐劑是較為安全的。先天性免疫不僅僅是抵抗病原體侵襲的第一道屏障，而且在識別和區(qū)分病原體、啟動獲得性免疫中起了關(guān)鍵的作用，抗原遞呈細胞尤其是樹突狀細胞在其中擔(dān)負了非常重要的角色?？乖f呈細胞具有所謂的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），可以識別病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）。鞭毛蛋白是一種蛋白性的PAMP，可以被PRR

4、 主要是細胞表面Toll 樣受體5（Toll-likereceptor 5，TLR5）識別和區(qū)分，兩者特異性結(jié)合后鞭毛蛋白即可作用于表達有TLR5的細胞，如上皮細胞、內(nèi)皮細胞、粒細胞、單核細胞、T淋巴細胞、NK細胞、樹突細胞等，通過激活TLR5，活化MyD88 依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控TNF-α、IL-6和IL-12等促炎細胞因子的合成，上調(diào)協(xié)同刺激分子CD80、CD86 以及MHCⅡ分子，從而使這些主要的抗原遞呈細胞激活和成熟，攝取抗

5、原能力增強，向引流淋巴結(jié)遷移能力增強，從而招引、激活和分化T 輔助細胞，最終啟動獲得性免疫應(yīng)答，實現(xiàn)免疫佐劑功效。而對于細胞胞質(zhì)內(nèi)部的鞭毛蛋白則主要依賴表達在細胞胞質(zhì)中的NOD 樣受體(Nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptor, NLR）家族中的IPAF（IL-1β-converting enzyme (ICE) protease activating factor）和N

6、AIP5（neuronAlapoptosisinhibitory protein 5）受體，其中IPAF 受體起主要的識別作用，而NAIP5 則可與IPAF聯(lián)合作用，起到增強細胞對胞質(zhì)內(nèi)鞭毛蛋白的識別作用。
　　 目前許多疾病的疫苗候選抗原都面臨在人體內(nèi)低免疫原性的問題，例如惡性瘧原蟲裂殖子頂端膜抗原1(apicAlmembrane antigen 1,AMA-1)蛋白，臨床試驗表明使用鋁佐劑或Montanide ISA720佐

7、劑都不能使AMA1在絕大多數(shù)受試者中激發(fā)出有效水平的抗體滴度，當(dāng)在鋁佐劑中添加了Toll 樣受體9（TLR9）的激動劑CpG ODN后，在受試者中抗AMA1的抗體水平得到了極大提高，并且高滴度的免疫血清在瘧原蟲體外抑制試驗中的抑制率可達到90％以上，最高者達到96％。然而，由于在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)1例由CpG ODN 產(chǎn)生的副反應(yīng)，所以CpG ODN的安全性已成為這種AMA1疫苗制劑在臨床試驗中進一步推進的重要障礙。
　　 本研究工

8、作將以作為TLR5 激動劑的純化沙門氏菌鞭毛蛋白（flagella filamentprotein，F(xiàn)liC）替代作為TLR9 激動劑的CpG ODN1826，加入到模型抗原——卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）和氫氧化鋁佐劑的疫苗制劑中，免疫實驗小鼠，觀察和比較添加鞭毛蛋白的疫苗制劑所激發(fā)的免疫應(yīng)答，為鞭毛蛋白作為佐劑增強劑應(yīng)用于以各種低免疫原性候選抗原的疫苗提供實驗數(shù)據(jù)。
　　 二、研究目的
　　 本實驗擬通過大

9、樣本隨機對照的研究方法，在BALB/c小鼠中，研究鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白增強抗原特異性抗體應(yīng)答的佐劑增強劑功效及其機制，同時與CpGODN 進行比較，觀察兩者佐劑增強劑功效的差別，以及采用不同免疫方式對鞭毛蛋白作為佐劑增強劑的影響。
　　 三、研究方法
　　 1、采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）測定血漿中特異性抗OVA的IgG抗體滴度，以及各種IgG分型

10、抗體（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）的滴度。
　　 2、采用ELISA 法測定小鼠脾細胞體外刺激上清中干擾素gamma（Interferon γ，IFN-γ）和白介素4（Interleukin-4，IL-4）的含量。3、采用TurboFect 體外轉(zhuǎn)染試劑構(gòu)建穩(wěn)定表達pUNO-hTLR5 質(zhì)粒的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7細胞株。
　　 四、研究結(jié)果
　　 1、采用肌肉注射免疫方式聯(lián)合應(yīng)用鞭毛蛋

11、白的卵清蛋白/ 氫氧化鋁佐劑（OVA+Alhydrogel+Flagellin）組誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗OVA抗體滴度顯著高于OVA+Alhydrogel組，低于聯(lián)合應(yīng)用CpG ODN組，但隨著免疫時間的延長，聯(lián)合應(yīng)用鞭毛蛋白組特異性抗體滴度逐漸高于聯(lián)合應(yīng)用CpG ODN組。整個免疫過程中，鞭毛蛋白顯示出與CpG ODN 相當(dāng)?shù)拿庖咦魟┕πА?br>　　 2、肌肉免疫方式中添加鞭毛蛋白組特異性抗體亞型中IgG2a和IgG2b 比例較單純鋁佐

12、劑組升高。體外刺激添加鞭毛蛋白組小鼠脾臟細胞培養(yǎng)基上清中檢測到較單純鋁佐劑組高水平的IFN-γ和低水平的IL-4，考慮由鼠沙門氏菌鞭毛蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是Th1/Th2 混合型，但以Th1型為主，且可通過經(jīng)典途徑活化補體系統(tǒng)，全面提高機體對外源性抗原的特異性體液免疫反應(yīng)及細胞免疫反應(yīng)。3、采用皮下注射免疫和腹腔注射免疫方式，整個免疫過程中添加鞭毛蛋白或者CpGODN組特異性抗體滴度都顯著高于單純應(yīng)用鋁佐劑組，且添加CpG ODN組升高更

13、為明顯。
　　 4、皮下注射免疫和腹腔注射免疫方式中鞭毛蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答機制與肌肉免疫方式中一致，只是采用皮下免疫后特異性抗體IgG2b 比例未見明顯升高，考慮此種免疫方式下鞭毛蛋白不能有效活化補體系統(tǒng)。
　　 5、成功構(gòu)建穩(wěn)定表達pUNO-hTLR5 質(zhì)粒的小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 轉(zhuǎn)染細胞株。
　　 五、研究結(jié)論
　　 本研究首次采用鋁佐劑的吸附作用，選取新型免疫佐劑鞭毛蛋白，體外將鼠傷寒沙