小檗堿通過(guò)SIRT1途徑抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、胰島素靶組織的慢性炎癥是引起胰島素敏感性下降的主要病因，巨噬細(xì)胞是引發(fā)這種慢性炎癥狀態(tài)的主要細(xì)胞類型。黃連是臨床常用的治療2型糖尿病的中藥，其有效成分小檗堿已被證實(shí)具有改善巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用，其作用機(jī)制尚不十分明確。SIRT1是一種去乙酰化酶，可以延長(zhǎng)壽命，調(diào)控細(xì)胞凋亡，改善糖脂代謝和炎癥反應(yīng)。由于小檗堿的抗炎特性與SIRT1的作用靶點(diǎn)和生物學(xué)效應(yīng)基本一致，因此深入研究?jī)烧叩年P(guān)系有助于為小檗堿多種藥理效應(yīng)的機(jī)制研究提供線索，也對(duì)中醫(yī)

2、藥治療2型糖尿病提供新的思路。
　　目的:
　　運(yùn)用體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，觀察小檗堿對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子和SIRT1表達(dá)的影響及SIRT1對(duì)小檗堿抗炎作用的影響，初步探討小檗堿的抗炎作用機(jī)制。
　　方法:
　　1) MTT法檢測(cè)小檗堿不同濃度(1、5、10、50、100umol/L)對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性;2）分別給予不同濃度(1、5umol/L)的小檗堿預(yù)處理RAW264.7巨噬細(xì)胞24

3、小時(shí)后，棄去藥物維持液，更換為含有100ng/ml的LPS藥物維持液的培養(yǎng)液，采用熒光定量PCR法檢測(cè)巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、MCP-1的基因表達(dá);3）將RAW264.7巨噬細(xì)胞分為四組:對(duì)照組，BBR組，LPS組和BBR+LPS組，小檗堿濃度為5umol/L，預(yù)處理24小時(shí)后，棄去藥物維持液，更換培養(yǎng)液，LPS作用濃度為100ng/ml，6小時(shí)后提取RNA和蛋白樣本，采用熒光定量PCR法和蛋白免疫印跡法檢測(cè)樣本中的SIRT1表達(dá)

4、量;4）用SIRT1特異性抑制劑EX527和siRNA干擾技術(shù)分別對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理并設(shè)立各自對(duì)照組，將其隨機(jī)分為空白組，LPS組和LPS+BBR組，小檗堿濃度為5umol/L，預(yù)處理24小時(shí)后，棄去藥物維持液，更換培養(yǎng)液，LPS作用濃度為100ng/ml,6小時(shí)后提取RNA樣本，采用熒光定量PCR法檢測(cè)樣本中TNF-α、IL-6、MCP-1的基因表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1)小檗堿低濃度(1、5umol/L

5、)對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性(P＞0.05)，而中、高濃度的小檗堿(10、50、100umol/L)對(duì)巨噬細(xì)胞活性有明顯的抑制作用(P＜0.05);
　　2)與1umol/L的小檗堿相比，5umol/L的小檗堿能夠顯著地抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎因子TNF-α，IL-6，MCP-1的表達(dá)(P＜0.05);
　　3)在基因水平，小檗堿在基礎(chǔ)狀態(tài)下和炎癥狀態(tài)下均可上調(diào)巨噬細(xì)胞中SIRT1基因的表達(dá)(P＜0.05

6、)，在蛋白水平，基礎(chǔ)狀態(tài)下，小檗堿對(duì)巨噬細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯影響(P＞0.05)，而炎癥狀態(tài)下，小檗堿可以明顯上調(diào)巨噬細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)(P＜0.05)，此外，研究還發(fā)現(xiàn)，LPS抑制巨噬細(xì)胞中SIRT1的表達(dá)(P＜0.05)。
　　4) SIRT1抑制劑EX527增加了LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞促炎因子的基因表達(dá)，同時(shí)減弱了小檗堿的抗炎作用;利用RNA干擾技術(shù)敲低RAW264.7巨噬細(xì)胞中的SIRT1，增

7、加了炎癥狀態(tài)下巨噬細(xì)胞的促炎因子的基因表達(dá)，減弱了小檗堿的抗炎作用。
　　結(jié)論:
　　1)5umol/L的小檗堿對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性，并且能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞促炎因子的表達(dá);
　　2)基礎(chǔ)狀態(tài)下，小檗堿能夠上調(diào)巨噬細(xì)胞中SIRT1的基因表達(dá)，而對(duì)蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著影響;而炎癥狀態(tài)下，小檗堿可以顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞中SIRT1的基因和蛋白表達(dá);
　　3)抑制SIRT1增加LPS誘導(dǎo)的RA