鹽酸小檗堿對(duì)脂多糖所致巨噬細(xì)胞炎癥的抗炎作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　本實(shí)驗(yàn)研究通過基因、蛋白水平研究鹽酸小檗堿對(duì)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7的體外抗炎作用，以及從NF-κB和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和COX-2介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)來研究其抗炎的分子作用機(jī)制，初步探討鹽酸小檗堿的抗炎作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、用0.1μg/mL的LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞，使其發(fā)生炎癥反應(yīng)。18h后檢測(cè)細(xì)胞上清液中TNF-α，IL-6炎癥因子的表達(dá)量來確定炎癥模型的構(gòu)建。

2、r>　　2、MTT法檢測(cè)鹽酸小檗堿低、中、高濃度（5、10、15μg/mL）對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
　　3、分別給予不同濃度的鹽酸小檗堿預(yù)作用于巨噬細(xì)胞RAW264.73 h后，再加入LPS至其終濃度為0.1μg/mL共同作用細(xì)胞18h后收集細(xì)胞上清液，分別用ELISA、qPCR方法從蛋白和基因水平檢測(cè)細(xì)胞炎癥介質(zhì)Mincle、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表達(dá)量。
　　4、Wester

3、n blot法檢測(cè)鹽酸小檗堿對(duì)NF-κB信號(hào)通路中的IκB-α磷酸化蛋白（p-IκB-α）、IκB-α總蛋白(Iκ B-α)、p65磷酸化蛋白(p-p65)、p65總蛋白(p65)表達(dá)的影響及MAPK信號(hào)通路中的起主要作用的ERK1/2磷酸化蛋白(p-ERK1/2)、ERK1/2總蛋白(ERK1/2)、JNK1/2磷酸化蛋白(p-JNK1/2)、JNK1/2總蛋白(JNK1/2)、p38磷酸化蛋白(p-p38)、p38總蛋白(p38)表

4、達(dá)的影響。
　　5、Western blot法檢測(cè)鹽酸小檗堿對(duì)花生四烯酸裂解為前列腺素(PG)過程中的一類重要的限速酶COX-2的作用及用ELISA方法檢測(cè)鹽酸小檗堿對(duì)其下游釋放的NO、PGE2的作用。
　　結(jié)果:
　　1、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7被0.1μg/mL LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型成功建立，模型細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α、IL-6炎性因子的表達(dá)量明顯升高，與正常組比較存在著顯著性差異(P＜0.

5、01)。
　　2、鹽酸小檗堿低、中、高濃度（5、10、15μg/mL）對(duì)RAW264.7細(xì)胞的幾乎沒有細(xì)胞毒性時(shí)，與正常組細(xì)胞相比較，細(xì)胞相對(duì)活力均大于90％。
　　3、與LPS炎癥模型組比較，在蛋白和基因水平，不同濃度的鹽酸小檗堿都能夠顯著性地降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6細(xì)胞促炎癥因子的表達(dá)量和顯著性提高LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中抗炎因子IL-10的表達(dá)，此外還能夠在mRN

6、A上抑制Mincle的表達(dá)(P＜0.05)。
　　4、對(duì)鹽酸小檗堿抗炎分子作用機(jī)制進(jìn)行了研究，研究結(jié)果顯示鹽酸小檗堿能夠顯著性地降低NF-κB信號(hào)通路中p65蛋白磷酸化水平、IκB-α磷酸化水平，提高IκB-α總蛋白表達(dá)水平(P＜0.01);顯著性降低MAPK信號(hào)通路中ERK1/2、JNK1/2蛋白的磷酸化水平，顯著性地提高ERK1/2、JNK1/2總蛋白的表達(dá)水平(P＜0.01);但對(duì)p38蛋白幾乎沒有作用。
　　5、鹽酸

7、小檗堿能夠顯著性降低LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中COX-2蛋白、NO、PGE2的表達(dá)，且呈劑量關(guān)系(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　在體外用0.1μg/mL的LPS成功構(gòu)建了巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥的反應(yīng)模型，并且低、中、高不同濃度的鹽酸小檗堿都能夠顯著性地抑制促炎因子的表達(dá)量且顯著性地提高一些抗炎因子的表達(dá)水平，這些結(jié)果提示鹽酸小檗堿在體外實(shí)驗(yàn)中有很好的抗炎作用。進(jìn)一步對(duì)其抗炎的信號(hào)通路進(jìn)行研究結(jié)果表明，鹽酸小檗堿對(duì)MAPK