小檗堿抑制腫瘤細胞Cyclin D1相關信號通路的研究.pdf

1、目前，腫瘤的發(fā)病率和死亡率在中國乃至世界仍居高不下，它不僅給患者本人及其家庭帶來巨大的痛苦，同時也對整個社會的發(fā)展與進步造成極大的威脅。因此，尋求安全、有效、低毒的抗腫瘤藥物一直受到國內外醫(yī)藥界專家學者的重視，而從天然化合物中開發(fā)此類藥物也成為研究熱點。所有癌細胞的一個特異性表型異常是細胞周期調控失調，細胞周期的調控與多種細胞內信號通路有關，阻斷細胞內信號通路從而抑制細胞周期正調控相關蛋白表達是抑制腫瘤細胞異常增殖的關鍵。本研究在確定小

2、檗堿對腫瘤細胞周期的阻滯作用和對周期進展關鍵蛋白Cyclin D1的抑制作用的基礎上，研究其對Cyclin D1相關信號通路的作用，探討小檗堿抑制Cyclin D1轉錄的分子機制，為闡明小檗堿阻滯腫瘤細胞周期進展、抑制腫瘤細胞增殖的作用機理提供實驗依據，并為小檗堿抗腫瘤的臨床應用提供理論依據。 第一部分：研究小檗堿對人高轉移性肺癌PG細胞周期進展和Cyclin D1表達的影響。 1．培養(yǎng)人高轉移性肺癌PG細胞，采用MTT

3、法檢測小檗堿對PG細胞增殖的作用。與對照組相比，經不同濃度(10μg/ml，2μg/ml，40μg/ml)的小檗堿處理24小時和48小時，PG細胞生長明顯受到抑制。 2．流式細胞儀檢測小檗堿對PG細胞周期進展的影響，結果表明，小檗堿可使G0/G1期細胞增多，而S期和G2/M期細胞減少，與對照組相比有顯著差異(P<0.01)；小檗堿高低劑量組間有明顯差異(P<0.05)。 3．RT-PCR結果顯示，經不同濃度小檗堿處理后2

4、4小時，PG細胞Cyclin D1的mRNA水平較對照組明顯降低。小檗堿對PG細胞Cyclin D1的表達有抑制作用。 第二部分：研究小檗堿對PG細胞Cyclin D1相關信號通路的作用。在確定小檗堿對腫瘤細胞周期的阻滯作用和對周期進展關鍵蛋白Cyclin D1的抑制作用的基礎上，研究其對Cyclin D1相關信號通路的作用，探討小檗堿抑制Cyclin D1轉錄的分子機制。 1．雙熒光素酶報告基因結果顯示，小檗堿對PG細

5、胞AP-1，Wnt信號通路活性有明顯抑制作用，而對NF-кB信號通路影響不明顯。進一步實驗表明，經PDB+Ionomysin處理的PG細胞AP-1信號通路被激活，小檗堿能有效抑制這種激活，其作用呈劑量依賴性。 2．Western Blot檢測表明，經不同濃度小檗堿處理后，PG細胞內與Cyclin D1轉錄密切相關的AP-1轉錄因子組分c-Jun蛋白含量明顯降低，降低的水平與小檗堿濃度相關。 3．EMSA結果顯示，不同濃度

6、的小檗堿均能抑制PG細胞核提取物與帶有野生型AP-1位點的寡核苷酸結合；經小檗堿處理后PG細胞核提取物與Cvclin D1上游啟動子區(qū)帶有AP-1位點的寡核苷酸結合減少。實驗結果提示： 1．小檗堿通過抑制周期進展關鍵蛋白Cvclin D1，阻滯PG細胞周期進展，從而抑制PG細胞增殖。 2．小檗堿對Cyclin D1相關信號通路AP-1和Wnt的活性具有抑制作用，對NF-кB通路活性影響不明顯。小檗堿對異常激活的AP-1信