紡錘鏈霉菌SD-07中多烯抗真菌抗生素濟南霉素的生物合成及基因敲除初探.pdf

1、紡錘鏈霉菌（Streptomyces netropsis）SD-07是本實驗室2007年發(fā)現(xiàn)的一株放線菌，它所產(chǎn)的多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是以五烯和七烯為主的混合物，五烯含量最高，并且五烯類的抗生素已經(jīng)解析出化學(xué)結(jié)構(gòu)，命名為濟南霉素(Jinanmycin)，相比兩性霉素B及制霉菌素，SD-07所產(chǎn)抗生素有更強的抗真菌活性，具有開發(fā)為新型抗真菌抗生素的潛力，因此有必要對濟南霉素在SD-07中的生物合成路徑以及其合成相關(guān)PKS基因簇的基因敲除工

2、作進行一系列研究與探索。
　　本文工作如下:
　　1.紡錘鏈霉菌SD-07全基因組掃描測序完成，并對濟南霉素在SD-07中的生物合成進行了詳細(xì)生物信息學(xué)分析
　　SD-07基因組堿基總數(shù)為7593656bp，經(jīng)antismash預(yù)測分析，共得到46個基因簇，其中cluster32最有可能為紡錘鏈霉菌SD-07多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的編碼基因簇，定位于4266507-4419580 bp，總大小153074bp，其中PKS

3、相關(guān)基因定位于4286507-4388174bp，總大小101667bp，推測為合成濟南霉素的基因簇。接下來對濟南霉素在SD-07中的生物合成路徑進行了詳細(xì)的描述與生物信息學(xué)分析:濟南霉素大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的合成開始于JinA，經(jīng)JinB、JinC、JinD、JinE和JinF一步步聚合，最后由JinF-TE將聚酮長鏈從PKS上水解下來并環(huán)化成大環(huán)內(nèi)酯環(huán)，接下來對該大環(huán)內(nèi)酯環(huán)進行后修飾，JinⅠ將C16甲基支鏈氧化成羧基，通過GDP-甘露糖脫水

4、酶JinGⅢ，氨基轉(zhuǎn)移酶JinGⅡ以及一些初級代謝中的酶將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為GDP-放線菌糖胺，然后通過JinGⅠ將GDP-放線菌糖胺與兩性霉素的糖苷配基核心相結(jié)合。最后可由JinMⅠ和JinMⅡ這兩種ABC型轉(zhuǎn)運蛋白負(fù)責(zé)將濟南霉素主動運輸?shù)郊忓N鏈霉菌SD-07外。本研究對SD-07的基因敲除工作奠定了基礎(chǔ)。
　　2.成功構(gòu)建兩個SD-07敲除載體，并進行基因敲除嘗試
　　在復(fù)制型質(zhì)粒pJTU1278的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了敲除

5、載體pJTU1278-⊿5883與pJTU1278-⊿2166，嘗試用接合轉(zhuǎn)移，電轉(zhuǎn)化及PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法對紡錘鏈霉菌SD-07的基因敲除進行一系列嘗試，并且對實驗條件進行了一系列優(yōu)化，但是最終都沒能得到正確轉(zhuǎn)化子。對于以上結(jié)果，我們認(rèn)為復(fù)制型質(zhì)粒不適合轉(zhuǎn)入紡錘鏈霉菌SD-07。
　　3.采用Red/ET重組對SD-07中PKS基因簇的克隆進行了探索
　　Red/ET重組工程是在E.coli細(xì)胞內(nèi)利用同源重組對DNA

6、序列進行精確修飾的基因工程技術(shù)。通過Red/ET重組工程對多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的相關(guān)PKS基因簇克隆進行了一系列嘗試，將110kb左右的相關(guān)PKS基因簇通過酶切分為兩部分進行克隆，較小的DNA片段為40kb左右，正確重組并成功篩選得到;然而當(dāng)嘗試將65kb左右的較大DNA片段與載體重組時，雖然成功長出很多克隆，但是當(dāng)我們對其一進行篩選時，卻得不到我們想要的正確克隆;再進行了多次嘗試后，依然沒有正確的克隆，分析可能是65kb的DNA片段較

7、大，不容易進行克隆。我們又重新進行了實驗方案的設(shè)計，將65kb的片段酶切成20kb左右以及40kb左右的片段進行克隆，對40kb左右的片段進行克隆時，同樣沒有出現(xiàn)正確的克隆。分析原因很可能是因為紡錘鏈霉菌SD-07某些基因的表達產(chǎn)物對Ecoli有毒，導(dǎo)致重組成功的克隆都死掉了。通過文獻查詢發(fā)現(xiàn)有過這種情況發(fā)生。
　　盡管目前SD-07基因敲除的工作沒有完成，但是本研究對今后的工作提供了一系列指導(dǎo)，本實驗室會繼續(xù)進行SD-07基因敲