紡錘鏈霉菌SD-07中多烯抗真菌抗生素濟(jì)南霉素的生物合成及基因敲除初探.pdf

1、紡錘鏈霉菌（Streptomyces netropsis）SD-07是本實(shí)驗(yàn)室2007年發(fā)現(xiàn)的一株放線菌，它所產(chǎn)的多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是以五烯和七烯為主的混合物，五烯含量最高，并且五烯類的抗生素已經(jīng)解析出化學(xué)結(jié)構(gòu)，命名為濟(jì)南霉素(Jinanmycin)，相比兩性霉素B及制霉菌素，SD-07所產(chǎn)抗生素有更強(qiáng)的抗真菌活性，具有開發(fā)為新型抗真菌抗生素的潛力，因此有必要對(duì)濟(jì)南霉素在SD-07中的生物合成路徑以及其合成相關(guān)PKS基因簇的基因敲除工

2、作進(jìn)行一系列研究與探索。
　　本文工作如下:
　　1.紡錘鏈霉菌SD-07全基因組掃描測(cè)序完成，并對(duì)濟(jì)南霉素在SD-07中的生物合成進(jìn)行了詳細(xì)生物信息學(xué)分析
　　SD-07基因組堿基總數(shù)為7593656bp，經(jīng)antismash預(yù)測(cè)分析，共得到46個(gè)基因簇，其中cluster32最有可能為紡錘鏈霉菌SD-07多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的編碼基因簇，定位于4266507-4419580 bp，總大小153074bp，其中PKS

3、相關(guān)基因定位于4286507-4388174bp，總大小101667bp，推測(cè)為合成濟(jì)南霉素的基因簇。接下來(lái)對(duì)濟(jì)南霉素在SD-07中的生物合成路徑進(jìn)行了詳細(xì)的描述與生物信息學(xué)分析:濟(jì)南霉素大環(huán)內(nèi)酯環(huán)的合成開始于JinA，經(jīng)JinB、JinC、JinD、JinE和JinF一步步聚合，最后由JinF-TE將聚酮長(zhǎng)鏈從PKS上水解下來(lái)并環(huán)化成大環(huán)內(nèi)酯環(huán)，接下來(lái)對(duì)該大環(huán)內(nèi)酯環(huán)進(jìn)行后修飾，JinⅠ將C16甲基支鏈氧化成羧基，通過(guò)GDP-甘露糖脫水

4、酶JinGⅢ，氨基轉(zhuǎn)移酶JinGⅡ以及一些初級(jí)代謝中的酶將果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為GDP-放線菌糖胺，然后通過(guò)JinGⅠ將GDP-放線菌糖胺與兩性霉素的糖苷配基核心相結(jié)合。最后可由JinMⅠ和JinMⅡ這兩種ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)將濟(jì)南霉素主動(dòng)運(yùn)輸?shù)郊忓N鏈霉菌SD-07外。本研究對(duì)SD-07的基因敲除工作奠定了基礎(chǔ)。
　　2.成功構(gòu)建兩個(gè)SD-07敲除載體，并進(jìn)行基因敲除嘗試
　　在復(fù)制型質(zhì)粒pJTU1278的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了敲除

5、載體pJTU1278-⊿5883與pJTU1278-⊿2166，嘗試用接合轉(zhuǎn)移，電轉(zhuǎn)化及PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法對(duì)紡錘鏈霉菌SD-07的基因敲除進(jìn)行一系列嘗試，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了一系列優(yōu)化，但是最終都沒(méi)能得到正確轉(zhuǎn)化子。對(duì)于以上結(jié)果，我們認(rèn)為復(fù)制型質(zhì)粒不適合轉(zhuǎn)入紡錘鏈霉菌SD-07。
　　3.采用Red/ET重組對(duì)SD-07中PKS基因簇的克隆進(jìn)行了探索
　　Red/ET重組工程是在E.coli細(xì)胞內(nèi)利用同源重組對(duì)DNA

6、序列進(jìn)行精確修飾的基因工程技術(shù)。通過(guò)Red/ET重組工程對(duì)多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的相關(guān)PKS基因簇克隆進(jìn)行了一系列嘗試，將110kb左右的相關(guān)PKS基因簇通過(guò)酶切分為兩部分進(jìn)行克隆，較小的DNA片段為40kb左右，正確重組并成功篩選得到;然而當(dāng)嘗試將65kb左右的較大DNA片段與載體重組時(shí)，雖然成功長(zhǎng)出很多克隆，但是當(dāng)我們對(duì)其一進(jìn)行篩選時(shí)，卻得不到我們想要的正確克隆;再進(jìn)行了多次嘗試后，依然沒(méi)有正確的克隆，分析可能是65kb的DNA片段較

7、大，不容易進(jìn)行克隆。我們又重新進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)，將65kb的片段酶切成20kb左右以及40kb左右的片段進(jìn)行克隆，對(duì)40kb左右的片段進(jìn)行克隆時(shí)，同樣沒(méi)有出現(xiàn)正確的克隆。分析原因很可能是因?yàn)榧忓N鏈霉菌SD-07某些基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)Ecoli有毒，導(dǎo)致重組成功的克隆都死掉了。通過(guò)文獻(xiàn)查詢發(fā)現(xiàn)有過(guò)這種情況發(fā)生。
　　盡管目前SD-07基因敲除的工作沒(méi)有完成，但是本研究對(duì)今后的工作提供了一系列指導(dǎo)，本實(shí)驗(yàn)室會(huì)繼續(xù)進(jìn)行SD-07基因敲