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文檔簡介
1、安莎霉素是一類結構獨特的抗生素,這一類型化合物通常具有很強的抗細菌、抗真菌、抗癌、抗病毒活性,主要分布在放線菌中,其中一個子類maytansinoids也存在于高等植物和苔蘚中,但是多方面的證據(jù)顯示植物中的maytansinoids可能是由其內生菌合成的。
為了尋找更多的安莎霉素類化合物,我們嘗試了3種策略,第一種是通過純培養(yǎng)建立菌種庫,通過逐級PCR篩選獲得AHBA(3-amino-5-hydroxybenzoic ac
2、id)合酶基因陽性菌株,優(yōu)化發(fā)酵條件,分離得到安莎霉素并對其進行結構鑒定;第二種是對樣品中的微生物直接進行平板培養(yǎng),然后結合平板影印和逐級PCR篩選,獲得AHBA陽性菌株,后續(xù)工作同上;第三種策略繞過了純培養(yǎng)障礙,主要以未培養(yǎng)微生物為研究對象,首先建立宏基因組文庫,從中篩選安莎霉素生物合成基因簇,通過基因簇異源表達獲得其所編碼的安莎霉素。
通過基于安莎霉素生物合成中特異的AHBA合酶基因的PCR篩選,從約800株放線菌中篩
3、選到19株潛在的安莎霉素產(chǎn)生菌,優(yōu)化培養(yǎng)條件后,TLC檢測顯示至少有5株可能產(chǎn)生安莎霉素類化合物,對其中一株鏈霉菌LZ35的系統(tǒng)分離得到了8個安莎霉素類化合物,其中一個為新化合物。
通過AHBA合酶基因的雜交篩選,從包含約177萬個克隆的滑桃樹內生菌宏基因組文庫中篩選得到兩個安莎霉素合成基因簇,序列分析顯示這兩個基因簇具有非常相似的基因結構,可能合成類似的化合物。其中M1464克隆攜帶有安莎霉素合成所需的全部PKS基因,因
4、此將其進行異源表達。將具有接合轉移和整合功能的CIS元件引入M1464 fosmid中,然后通過接合轉移將其導入安莎霉素產(chǎn)生菌Streptomyces sp.CS中,HPLC-UV檢測發(fā)現(xiàn)轉化子的SFM培養(yǎng)基發(fā)酵提取物與野生型相比存在一個明顯的額外組分,對其所含化合物的分離和結構鑒定仍在進行中。
以上結果表明基于基因水平的篩選是行之有效的快速尋找新安莎霉素類化合物的方法,為大規(guī)模尋找新的安莎霉素類藥物先導化合物提供了可能。
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