一種核苷嘧啶類抗真菌抗生素的分離純化及抗菌活性的研究.pdf

1、近年來，深部真菌感染疾病的感染率逐漸提高，對患者的健康和生命造成了很大的威脅。課題組篩選得到一株芽孢桿菌，能產(chǎn)生核苷嘧啶類抗真菌抗生素，對引起深部真菌感染的白色念珠菌具有很好的抑制作用。論文在研究該抗生素發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上，重點研究該抗生素的分離純化工藝，為該抗生素的進一步開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。
　　 本論文首先對該抗生素的搖瓶培養(yǎng)工藝進行了優(yōu)化，確定了較優(yōu)的發(fā)酵條件：pH6.5，接種量8％，轉(zhuǎn)速200 r/min，裝液量40mL/

2、250 mL，28℃下?lián)u瓶發(fā)酵48h后產(chǎn)抗水平最高達到940.35 U/mL；進一步在通氣攪拌罐中進行了放大，在搖瓶得到的優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，在通氣量為2 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，裝液量60％(v/v)條件下，培養(yǎng)36h后產(chǎn)抗水平達到最高，達到950.5 U/mL，比搖瓶培養(yǎng)略有提高。
　　 論文對抗生素發(fā)酵液的理化性質(zhì)作了簡單的考察，結(jié)果表明：該抗生素具有較強的熱穩(wěn)定性；在酸、中性環(huán)境下比較穩(wěn)定，堿性環(huán)境下不穩(wěn)定；低

3、溫條件下(-20℃)，該抗生素發(fā)酵液放置時間在9天以內(nèi)均可保持較高的活性；該抗生素對光照不敏感；是一種極性酸性水溶性抗生素。
　　 在以上研究基礎(chǔ)上，論文重點研究了該抗生素的分離純化工藝條件。本論文建立的抗生素分離工藝為：發(fā)酵液絮凝預處理一調(diào)發(fā)酵液pH2.0→H41大孔樹脂脫色→HD-8離子交換樹脂純化→(制備高效液相精制)→凍干。通過對工藝條件的優(yōu)化，實現(xiàn)該抗生素的分離和純化。本工藝路線首先采用了殼聚糖絮凝除菌，優(yōu)化后的條件為

4、：pH2.0、絮凝劑用量為0.4 g/L、溫度為30℃，絮凝率達到84.6％；以草酸和鹽酸為沉淀劑，分別在pH4.0和2.0下沉淀發(fā)酵液中的金屬離子和雜蛋白；大孔吸附樹脂H41對發(fā)酵液進行脫色，脫色條件為：pH為2.0的發(fā)酵液以2 BV/h的流速上柱，脫色率達到95.1％，抗生素效價提高到2332.18U/mL；選取了陽離子樹脂HD-8作離子交換層析實驗，優(yōu)化后的工藝條件為：pH為2.0的上柱液以2 BWh的流速上柱，在吸附達到平衡后用

5、去離子水沖洗后，再用0.6mol/L的NH3·H2O以4 BV/h的流速洗脫。洗脫液減壓蒸餾，冷凍干燥，得到淡黃色粉末，效價提高到5855.5 U/mg。整個分離過程的總收率為63.4％。
　　 HPLC檢測離子交換分離得到的產(chǎn)品，歸一法測定其純度為70.24％；抗生素粗品經(jīng)制備HPLC精制后，純度達到95.75％，最終效價達到8280.5U/mg。經(jīng)質(zhì)譜分析，其分子量為520.68。紫外掃描發(fā)現(xiàn)該抗生素在298 nm處有強吸收