玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63抗生素生物合成基因相關(guān)線性質(zhì)粒的研究.pdf

1、玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63是一株從馬鈴薯瘡痂病自然衰退土壤中分離的生防菌，能夠產(chǎn)生多種脂溶性抗生素，對(duì)多種植物病原菌有抑制作用。
　　 根據(jù)“鏈霉菌線性質(zhì)粒5＇末端都結(jié)合有共價(jià)蛋白”這一性質(zhì)，通過(guò)改進(jìn)瓊脂糖包埋塊制作方法，發(fā)明了一項(xiàng)高效快速檢測(cè)鏈霉菌質(zhì)粒種類和構(gòu)型的技術(shù)，即“包埋塊二次處理法”，并檢測(cè)出了Men-myco-93-63中存在兩種內(nèi)源線性質(zhì)粒。雙向電泳驗(yàn)證了該方法的正確性，推測(cè)質(zhì)粒大小分別約為47 kb

2、和53 kb。
　　 利用凍融法、SDS/高溫循環(huán)法和原生質(zhì)體法對(duì)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63內(nèi)源線性質(zhì)粒進(jìn)行消除，來(lái)檢測(cè)抗生素合成相關(guān)基因是否位于質(zhì)粒DNA上。結(jié)果表明，凍融法和SDS/高溫循環(huán)法分別能有效地獲取穩(wěn)定的缺失質(zhì)粒pSR47而保留pSR53的菌株P(guān)1、P2、P3、P4、P6、P7以及SH7、SH9，它們不能正常產(chǎn)生孢子，對(duì)棉花黃萎病菌V41的抑制作用消失，而對(duì)馬鈴薯瘡痂病菌H2的抑制作用不變或減弱。因此

3、推測(cè)線性質(zhì)粒pSR47可能含有抑制棉花黃萎病菌V41的抗生素合成相關(guān)基因和控制孢子形成的基因，而抑制馬鈴薯瘡痂病菌H2的抗生素合成相關(guān)基因定位在染色體或pSR53上。
　　 線性質(zhì)粒pSR53很難消除，推測(cè)pSR53可能含有宿主菌的持家基因。SDS/高溫循環(huán)質(zhì)粒消除法獲得的異形菌株SH10，開(kāi)始在PDA培養(yǎng)基上呈“光禿”型，產(chǎn)生黃色可溶色素，生物活性無(wú)變化，但在傳代培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)特征又恢復(fù)到野生型，推測(cè)玫瑰黃鏈霉菌Men-myc

4、o-93-63染色體DNA或pSR53含有類似于灰色鏈霉菌的形態(tài)分化adsA的基因，并受某種因子調(diào)控。
　　 利用“高鹽濃度下CTAB能使大部分糖類和脂類沉淀”的原理，改進(jìn)了提取基因組DNA的CTAB法，得到了符合構(gòu)建cosmid基因組文庫(kù)的大于150kb的基因組DNA，片段大小均一。利用“水煮后5＇末端結(jié)合有共價(jià)蛋白的線性質(zhì)粒能跟蛋白質(zhì)一起沉淀，而與染色體DNA分開(kāi)”的假設(shè)來(lái)分離線性質(zhì)粒，成功地提取了玫瑰黃鏈霉菌Men-myc

5、o-93-63的兩種線性質(zhì)粒，但產(chǎn)量較低，尚需進(jìn)一步優(yōu)化。
　　 通過(guò)克隆pSR47的端粒及構(gòu)建pSR47基因文庫(kù)，獲得了pSR47的DNA序列，目前拼接得到66個(gè)contigs，共131 428bp。核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，pSR47的一部分序列與先前得到的抗生素合成相關(guān)基因克隆子pSA31、pSA321和pSA32 一致，表明pSR47 與抗生素合成相關(guān)。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)pSR47 含有抗生素合成關(guān)鍵酶NRPSs/PKSs 雜