衰老過程中小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生及微環(huán)境改變的初步研究.pdf

1、目的:
　　成年哺乳動物的腦內(nèi)保留著一群具有自我更新能力和多方向分化潛能的細(xì)胞群，被稱之為神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)。神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)歷不對稱分裂成為定向祖細(xì)胞，并逐漸向功能區(qū)域遷移、發(fā)生可塑性變化并與其他神經(jīng)元建立突觸聯(lián)系，最終具有神經(jīng)元功能，這個過程是神經(jīng)發(fā)生。神經(jīng)發(fā)生對維持大腦功能和結(jié)構(gòu)有著重要的作用。在哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)中存在兩個主要的神經(jīng)發(fā)生區(qū)域:海馬齒狀回顆粒下層和側(cè)腦室下區(qū)。海馬齒狀回的神經(jīng)發(fā)生與高級功能，如學(xué)習(xí)、認(rèn)知、記憶

2、等密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報道成年海馬神經(jīng)干細(xì)胞通常處在靜止?fàn)顟B(tài)，在整個壽命中會重復(fù)幾次離開G0期，進(jìn)行不對稱分裂并在特定的微環(huán)境下調(diào)控下向神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞或星型膠質(zhì)細(xì)胞分化，然后再進(jìn)入靜止期。在衰老期，海馬的新生神經(jīng)元產(chǎn)生減少，這與記憶、認(rèn)知功能下降密切相關(guān)。關(guān)于衰老期海馬神經(jīng)發(fā)生減少的原因，目前研究人員的意見并不統(tǒng)一，歸納起來有四種猜測:1.海馬DG神經(jīng)干細(xì)胞大量凋亡;2.神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量不變，但處于靜止期的神經(jīng)干細(xì)胞比例上升，3.神經(jīng)干

3、細(xì)胞數(shù)量不改變，但向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的比例升高;4.神經(jīng)干細(xì)胞分化形成新生的神經(jīng)元迅速大量凋亡。
　　衰老過程中神經(jīng)發(fā)生減少已經(jīng)成為共識，但衰老期海馬神經(jīng)發(fā)生的具體哪個階段停滯或異常導(dǎo)致新生神經(jīng)元減少，與海馬中哪些因素的改變相關(guān)等問題還有待深入研究。本研究擬通過測定青年、中年、老年三個年齡段小鼠海馬齒狀回SGZ細(xì)胞的增殖能力、向神經(jīng)元方向分化的能力、神經(jīng)干細(xì)胞本身的數(shù)量改變、新生成神經(jīng)元的數(shù)量幾方面探討衰老進(jìn)程中小鼠海馬神經(jīng)發(fā)生的

4、改變;通過對金屬基質(zhì)蛋白酶9的表達(dá)、神經(jīng)營養(yǎng)因子含量的改變和海馬過氧化損傷及抗氧化能力觀察不同年齡階段海馬微環(huán)境的改變;并進(jìn)一步檢測海馬中衰老相關(guān)基因的表達(dá)。研究的目的是了解衰老小鼠中海馬神經(jīng)發(fā)生及其內(nèi)環(huán)境的改變，為促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生、延緩衰老，改善學(xué)習(xí)、認(rèn)知、記憶能力，提供可能途徑和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.C57BL/6J雄性小鼠27只，分為青年A組9只（2-3月齡），中年B組9只（6-8月齡），老年C組9只（18-

5、20月齡）。
　　2.麻醉灌注后斷頭取腦，石蠟包埋，作海馬區(qū)冠狀連續(xù)切片，隨機選取一個半腦，OCT包埋，海馬區(qū)冠狀連續(xù)冰凍切片，每只鼠選取三張非連續(xù)切片（按解剖標(biāo)志保證組間位于相同平面），免疫組化(SP法)檢測并計數(shù)海馬SGZ區(qū)nestin+(神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志)、DCX+（成神經(jīng)細(xì)胞）、PCNA+（增殖活躍）的細(xì)胞個數(shù)。
　　3.斷頭取腦，矢狀分成左右兩部分，隨機選取一個半腦，OCT包埋，海馬區(qū)冠狀連續(xù)冰凍切片，每只鼠選取三

6、張非連續(xù)切片（按解剖標(biāo)志保證組間位于同一平面），MMP-9（金屬基質(zhì)蛋白酶9，基質(zhì)退化程度指標(biāo)）免疫熒光染色，β-半乳糖苷酶（衰老程度指標(biāo)）染色。
　　4.麻醉后斷頭取腦，分離海馬，勻漿，離心收集上清，比色法測GSH含量和GSH-PX活性（抗氧化能力指標(biāo)），硫代巴比妥酸法檢測丙二醛(MDA，氧化損傷程度指標(biāo))含量。
　　5.麻醉后斷頭取腦、分離海馬、勻漿，離心收集上清、ELISA檢測各年齡組小鼠海馬神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GD

7、NF的改變。
　　6.斷頭取腦，分離海馬，提取海馬組織總RNA，RT-PCR檢測各年齡組小鼠海馬衰老相關(guān)基因p19Arf、p21Cp1/waf1mRNA表達(dá)的改變。
　　結(jié)果:
　　1.海馬神經(jīng)發(fā)生指標(biāo)顯示:
　　1)海馬SGZ NSCs(nestin+細(xì)胞)數(shù)分別在青年A組為(61.33±23.02)，中年B組(35±11.53)，老年C組(19.33±8.33); NSCs數(shù)量隨著年齡增長減少。
　　2

8、)海馬SGZ增殖活躍期的細(xì)胞數(shù)（PCNA+細(xì)胞）數(shù)分別在青年A組為(56.67±9.29)，中年B組(19±6.24)，老年C組(4.33±2.08); SGZ增殖活躍細(xì)胞數(shù)量隨著年齡增長減少。
　　3)海馬SGZ成神經(jīng)細(xì)胞（NBs，DCX+細(xì)胞）數(shù)分別在青年A組為(82.33±8.50)，中年B組(30±3)，老年C組(12.33±1.52); SGZ NBs數(shù)量隨著年齡增長減少。
　　2.海馬神經(jīng)發(fā)生微環(huán)境指標(biāo)顯示:

9、r>　　1)抗氧化能力指標(biāo)與氧化損傷程度:各年齡組海馬組織谷胱甘肽(GSH)的含量分別是青年A組(9.77±3.125)mg/gprot，中年B組(4.94±1.59)mg/gprot，老年組(3.94±1.11)mg/gprot; GSH-PX的活性分別是:青年A組(124.09±23.34)活力單位，中年B組(106.48±14.24)活力單位，老年C組(60.621±14.71)活力單位;隨著年齡增長海馬組織中GSH含量下降、GS

10、H-PX活性減弱。MDA含量分別為青年A組(8.3±0.8)nmol/mg，中年B組(9.7±1.57)nmol/mg，老年C組(12.8±1.9)nmol/mg;脂質(zhì)氧化物(MDA)含量增加。
　　2)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色:各組海馬CA區(qū)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)陽性強度隨年齡增加逐漸增高，β-半乳糖苷酶染色陽性區(qū)域集中在CA區(qū)，DG區(qū)未見表達(dá)。
　　3)各年齡小鼠海馬組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子的水平:B

11、DNF含量在青年A組為(107.42±18.55)pg/ml，中年B組為(89.04±15.7) pg/ml，老年組C為(58.45±15.29)pg/ml;GDNF含量在青年A組為(384.56±59.12)pg/ml;中年B組為(297.59±14.69)pg/ml;老年C組為(203.33±34.83)pg/ml。
　　4)海馬組織金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-9表達(dá)，在衰老期明顯增高，主要集中在CA區(qū)，DG區(qū)未見表達(dá)。
　　

12、3.衰老小鼠海馬衰老相關(guān)基因p19Arf、p21Cip1/Waf1 mRNA表達(dá)增高。
　　結(jié)論:
　　1.自然衰老小鼠海馬SGZ處于增殖活躍期細(xì)胞數(shù)、神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量和成神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量，與青年期相比都明顯減少，提示自然衰老的小鼠海馬SGZ神經(jīng)發(fā)生減少。
　　2.自然衰老小鼠海馬組織抗氧化能力的下降、氧化損傷程度增強，神經(jīng)營養(yǎng)因子水平下降，金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-9表達(dá)增加，可能與海馬SGZ神經(jīng)發(fā)生減少相關(guān)。
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