細胞復制性衰老及H-,2-O-,2-誘導的衰老過程中DNA甲基化的改變.pdf

1、按照聯(lián)合國的標準，60歲以上的人口超過10﹪就進入了老齡化社會，2005年統(tǒng)計，中國60歲以上人口是1.44億，占全國人口的11﹪。因此，中國已經(jīng)進入了老齡化社會。眾所周知，老年人由于身體組織結構逐步老化，器官功能障礙，身體抵抗力減弱，活動度降低以及協(xié)同功能喪失等多種原因，容易發(fā)生老年病如老年性精神病、老年性癡呆、老年性耳聾、腫瘤、高血壓、心血管疾病等；而且老年人的患病率和患病時間平均是一般人的2-3倍。如何減少老年人的發(fā)病率和提高老年

2、人的生活質量，是目前中國面臨的一個巨大挑戰(zhàn)。這個問題的解決在依靠政府重視，增加資金投入的同時，也離不開衰老的相關研究。 近十幾年來，衰老機制的研究是當今生命科學研究的一個熱點領域，也取得了一些進展。目前成熟的假說有遺傳決定學說、氧化損失學說(即自由基一線粒體理論)、衰老分化障礙學說(dys-differentiation hypothesis ofaging)、端粒一端粒酶學說、衰老基因學說<'[1-4]>等等。衰老機制的探討有

3、助于老年性疾病的診斷和治療，也為預防老年病提供重要的依據(jù)。 既往的衰老機制研究從遺傳角度考慮較多，表觀遺傳學(epigenetic)是與遺傳學(genetic)相對應的概念。遺傳學是指基于基因序列改變所致基因表達水平變化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等；而表觀遺傳學則是指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，如DNA甲基化和染色質構象變化等。隨著2001年2月15日人類基因組全序列草圖的基本完成，人類表基因組計劃在2

4、003年正式啟動，該計劃目的是繪制DNA上所有的甲基化位點，建立控制基因活性的主要化學變化圖譜。這個聯(lián)盟已經(jīng)完成了與組織相容性復合物相關的1，000，000個甲基化標簽，發(fā)現(xiàn)6號染色體有一部分與許多疾病相關。這是世界上首項針對控制人類基因“開”和“關”的主要成分進行的圖譜繪制工作，將有助于科學家建立人類遺傳、疾病和環(huán)境之間的關鍵聯(lián)系<'[5]>。關于表遺傳調(diào)節(jié)的一種最主要形式是DNA上胞嘧啶的甲基化，從而形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。

5、現(xiàn)在已經(jīng)清楚表明DNA甲基化在基因沉默、X染色體滅活、遺傳印記以及胚胎發(fā)育過程等方面起關鍵作用。有關DNA甲基化與腫瘤的關系研究在近些年來有多種發(fā)現(xiàn)：腫瘤組織整體基因組低甲基化和抑癌基因的高甲基化相伴隨；DNA甲基化參與基因的表達調(diào)控，啟動子區(qū)高甲基化抑制基因轉錄、低甲基化使基因過表達等等，這些為臨床診斷和治療腫瘤開辟了新的天地，例如通過去甲基化藥物降低抑癌基因啟動子區(qū)的高甲基化來治療腫瘤已經(jīng)廣泛用于臨床。對于不同腫瘤如肺癌、乳腺癌、膀

6、胱癌、結腸癌等等與DNA甲基化之間的關系研究已經(jīng)很多，但是衰老與DNA甲基化的關系研究，在國外處于剛起步狀態(tài)，國內(nèi)研究就更少?；蚪M甲基化修飾是衰老的原因還是衰老的結果?甲基化修飾對衰老的作用是通過什么樣的途徑實現(xiàn)的?這種作用是間接還是直接的呢?這些問題都有待于深入探討。依據(jù)1965年HarmanD提出的自由基理論：隨齡體內(nèi)線粒體產(chǎn)生自由基增多，所致細胞和組織損傷增多，而DNA修復能力卻逐步減弱<'[6]>，有關氧化應激與衰老關系的研究

7、逐步增加。目前最得到認可的體外細胞衰老模型常用H<,2>O<,2>誘導人二倍體成纖維細胞來獲得<'[7]>。在氧化應激致衰老過程中，基因P66<'shc>參與并起著非常重要的作用，P66<'shc>是近幾年才發(fā)現(xiàn)的長壽基因，它參與調(diào)節(jié)生長，在ROS信號反應過程中，是一個很重要的接合蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)p66<'shc-/->小鼠對抗氧化應激的能力增強，且壽齡比野生型小鼠延長30﹪；P66<'shc>。可以誘導永久性細胞周期停滯<'[8]>。

8、基因P66<'shc>在衰老過程的表達變化，報導結果不一。而胰島素樣生長因子2(IGF2)是目前發(fā)現(xiàn)的為數(shù)不多的印記基因之一，對胚胎和個體的生長發(fā)育有重要作用，近年發(fā)現(xiàn)許多遺傳病尤其惡性腫瘤中都存在該基因的印記丟失所致的IGF2高表達現(xiàn)象，這些基因隨齡表達如何改變，啟動子區(qū)甲基化的改變以及二者之間的關系?均有待于進一步研究。 本研究旨在探討細胞復制性衰老及氧化應激誘導(過氧化氫染毒)的衰老與DNA甲基化的關系，主要內(nèi)容有：細胞衰

9、老過程中整體DNA甲基化改變、衰老相關基因P66<'shc>、印記基因IGF<,2>的啟動子區(qū)甲基化的改變及其隨齡mRNA表達變化、DNMT1 mRNA表達及蛋白改變；不同劑量H<,2>O<,2>刺激細胞后，細胞上述指標的影響。方法一、H<,2>O<,2>染毒劑量的確定培養(yǎng)人胚肺成纖維細胞(HPF)細胞，待細胞貼壁24h后，換無血清培養(yǎng)基，使用不同濃度H<,2>O<,2>分別刺激細胞2h，用CCK-8試劑法分析細胞的增殖功能和毒性作用，

10、為后續(xù)實驗短期染毒確定低、中、高三個染毒劑量。 結論 一、成功建立細胞衰老模型，確定衰老條件和標準，為后續(xù)衰老機制研究提供基礎。10μM、100μM和200μM H<,2>O<,2>短期染毒細胞后，沒有改變細胞壽齡，但影響不同年齡階段的細胞生長增殖速度。 二、衰老基因P66<'shc>，其mRNA表達可作為判斷衰老的一個生物學指標指標。 三、正常細胞衰老過程中，整體基因組甲基化水平隨齡逐漸降低，H<,2