胞膜窖-窖蛋白在小鼠牙發(fā)育過程中作用的初步研究.pdf

1、二十世紀九十年代以來，隨著細胞生物學、分子生物學、免疫學以及遺傳學等基礎學科的迅猛發(fā)展以及干細胞和組織工程技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)學基礎研究和臨床中的應用，再生醫(yī)學已初步顯示出良好的發(fā)展前景，使得牙齒再生逐步成為可能，這引起了越來越多的學者對這一領域的關(guān)注。目前牙再生研究中的熱點主要集中在牙發(fā)育的分子網(wǎng)絡調(diào)控上。細胞信號轉(zhuǎn)導是胞膜窖/窖蛋白(caveolae/caveolin-1)最重要的生理功能之一。caveolae是細胞信號轉(zhuǎn)導的平臺，使各信號

2、通路的串話成為可能，caveolin-1處于該平臺中各個信號通路的中心位置。發(fā)育生物學研究證實，在顱神經(jīng)嵴細胞分化形成牙頜骨器官的過程中，先后經(jīng)歷了顱神經(jīng)嵴到第一鰓弓外胚間充質(zhì)再到牙頜骨外胚間充質(zhì)兩次關(guān)鍵性級聯(lián)分化。本課題旨在建立小鼠第一鰓弓外胚間充質(zhì)細胞及下頜第一磨牙牙胚間充質(zhì)細胞體外培養(yǎng)模型，在此基礎上，進行誘導分化研究，鑒定其細胞生物學特性。同時，采用分子生物學等技術(shù)手段，為揭示caveolae/caveolin-1在牙發(fā)育過程中

3、的分子調(diào)控機制提供理論依據(jù)。本研究共分以下幾個部分： 一.外胚間充質(zhì)細胞和牙胚間充質(zhì)細胞體外培養(yǎng)模型的建立。解剖分離E9.5小鼠第一鰓弓及E16.5小鼠下頜第一磨牙牙胚，采用改良酶消化法對其進行原代培養(yǎng)，利用反復貼壁和多次差異消化法對其進行純化，通過細胞形態(tài)觀察、細胞生長曲線描記、計算細胞倍增時間和特異性標記物檢測對其細胞生物學特性進行研究。在此基礎上，取第5代細胞，更換不同的條件培養(yǎng)液，觀察其在礦化誘導液的刺激下，細胞形態(tài)學變

4、化，并檢測鑒定相應的特異性細胞表型標記，對細胞的可塑性進行研究。 二．小鼠牙發(fā)育過程中caveolae/caveolin-1表達的初步研究。在間充質(zhì)細胞體外培養(yǎng)模型建立的基礎上，采用透射電子顯微鏡和流式細胞儀的方法觀察外胚間充質(zhì)細胞和牙胚間充質(zhì)細胞的生長周期中caveolae的超微形態(tài)變化，通過免疫組化和RT-PCR觀察caveolin-1在外胚間充質(zhì)細胞牙向分化過程中的表達情況，了解兩者之間可能存在的相互關(guān)系。 三．構(gòu)

5、建小鼠caveolin-1基因重組腺病毒載體。應用AdEasy重組腺病毒載體系統(tǒng)，以細菌內(nèi)質(zhì)粒間同源重組的方法構(gòu)建攜帶小鼠caveolin-1編碼區(qū)基因的復制缺陷型重組腺病毒載體pAd-caveolin-1，并在293細胞中擴增制備該重組腺病毒?？捎糜赾aveolin-1基因功能的研究，亦可應用于在牙組織工程中對種子細胞進行基因修飾和改造，模擬caveolin-1在體內(nèi)牙胚發(fā)育過程中的時空特異性表達。 四．caveolin-1過

6、表達促進cyclinD1介導的細胞增殖。通過pAd-caveolin-1轉(zhuǎn)染外胚間充質(zhì)細胞及牙胚間充質(zhì)細胞，用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細胞周期蛋白的改變，RT-PCR檢測細胞周期蛋白cyclin D1基因的表達，以明確caveolin-1是否參與了cyclinD1細胞增殖的調(diào)控作用。 研究結(jié)果表明E9.5胎鼠第一鰓弓界限清楚明確，便于準確取材，采用改良酶消化法原代培養(yǎng)細胞時間約2～3天，上皮細胞成分較少，可以在短時間內(nèi)獲得數(shù)量充足、

7、純度較高的滿足實驗要求的細胞。特異性標記物CD57免疫細胞化學染色呈均一表達。對外胚間充質(zhì)細胞及牙胚間充質(zhì)細胞的流式細胞儀檢測、電鏡觀察、免疫細胞染色及RT-PCR檢測顯示，這兩種細胞在增殖、caveolae的形態(tài)及基因的表達等方面均有差異，這提示caveolae和caveolin-1可能與細胞的增殖和成熟有關(guān)，通過小鼠caveolin-1基因重組腺病毒載體過表達caveolin-1，顯示轉(zhuǎn)染前外胚間充質(zhì)細胞中cyclin D1的表達高

8、于牙胚間充質(zhì)細胞eyclin D1的表達。轉(zhuǎn)染后兩種細胞中cyclin D1的表達都有明顯的下降，表明caveolin-1參與了cyclin D1介導的細胞增殖信號通路的調(diào)控。綜上所述，本研究建立了E9.5外胚間充質(zhì)細胞和E16.5牙胚間充質(zhì)細胞體外培養(yǎng)模型，所培養(yǎng)外胚間充質(zhì)細胞及牙胚間充質(zhì)細胞具有高度的增殖活性和自我更新能力，具有多向分化潛能。通過構(gòu)建小鼠的caveolin-1腺病毒表達載體，轉(zhuǎn)染外胚間充質(zhì)細胞和牙胚間充質(zhì)細胞，采用R