腸出血性大腸桿菌O157-H7單克隆抗體及膠體金免疫層析試紙條的研制.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一種重要的食源性病原菌,1982年該菌首先在美國(guó)被發(fā)現(xiàn),此后在世界各地散發(fā)或地方流行。該菌感染可引起出血性或非出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎(HC)、溶血性尿毒綜合征(HUS)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)等全身性并發(fā)癥。
　　 反芻動(dòng)物是EHEC O157:H7的主要貯存宿主,國(guó)內(nèi)外均有從牛羊等動(dòng)物的糞便中分離到該

2、菌的報(bào)道,目前普遍認(rèn)為受污染的環(huán)境、食物和水源是本病的主要傳播媒介。建立和完善動(dòng)物性食品及環(huán)境中EHEC O157:H7的檢測(cè)手段,是進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查以及該病防控的關(guān)鍵問(wèn)題之一。雖然分離培養(yǎng)鑒定仍是檢測(cè)EHECO157:H7的金標(biāo)準(zhǔn),但通常需要數(shù)天才能得到結(jié)果,不能滿足快速診斷的需要。分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法因具有特異、敏感、快速等特點(diǎn)在EHEC O157:H7檢測(cè)和診斷中發(fā)揮著愈來(lái)愈重要的作用。
　　 研究一:將E.coli O

3、157:H7用甲醛滅活,免疫BAILB/c小鼠,制備免疫脾細(xì)胞,與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,建立了5株能穩(wěn)定分泌抗E.coli O157:H7單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1B1、2D6、2D9、2E3和2G5。其中2G5的Ig亞類(lèi)為IgG3,其余四株均為IgM,輕鏈均為κ型,腹水抗體ELISA效價(jià)分別為1×105、1×104、1×106、1×107、1×107,凝集試驗(yàn)顯示五株單抗與EHEC O26:H11、EHEC O111等

4、其他受試菌株均不反應(yīng),具有良好的特異性。
　　 研究二:采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金,用純化的單克隆抗體2G5標(biāo)記,制備金標(biāo)抗體玻璃纖維素膜;將純化的2E3固定于硝酸纖維素膜(NC)上作為捕獲抗體;組裝成雙抗夾心法O157:H7膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條。用該試紙條可特異檢測(cè)O157:H7,敏感度為106CFU/ml,在1～5 min內(nèi)可得出檢測(cè)結(jié)果,與EHECO26:H11、EHEC O111等其他受試菌株均不反應(yīng);敏感性高,

5、特異性強(qiáng),便于O157:H7的臨床快速診斷與現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)樣品的快速篩查。
　　 研究三:采用灌胃攻毒方式,使小鼠感染O157:H7,用大腸桿菌O157檢測(cè)試紙條與O157:H7鑒別培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)兩種方法檢測(cè)感染小鼠糞便中的O157:H7的排菌量和排菌持續(xù)時(shí)間。結(jié)果顯示小鼠在感染O157:H7后2h開(kāi)始糞便排菌,6h達(dá)到峰值,排菌時(shí)間最長(zhǎng)可持續(xù)15d。大腸桿菌O157檢測(cè)試紙條與O157:H7鑒別培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)兩種方法的檢測(cè)結(jié)