基于等溫擴增技術的電化學生物傳感器對核酸檢測的新策略研究.pdf

1、核酸的超靈敏檢測在病原菌分析，分子診斷，腫瘤早期篩查，環(huán)境監(jiān)測及法醫(yī)鑒定等領域起著十分重要的作用，因而受到廣泛的關注。在核酸超靈敏檢測的多種分析方法中，恒溫擴增技術由于無需改變溫度越來越多的發(fā)展起來。電化學生物傳感器由于其獨特的優(yōu)點如操作簡便，響應快，成本低，及易于小型化等被廣泛應用于生物分子的檢測。本研究以電化學生物傳感器為檢測平臺，整合多種恒溫擴增技術，對核酸進行快速高靈敏檢測。研究內容分為以下兩部分:
　　1.基于等溫指數擴

2、增反應的電化學生物傳感器對miRNA快速靈敏檢測
　　MiRNA是一類內源性非編碼的小分子RNA，其異常表達與相關腫瘤的早期診斷，臨床用藥及預后判斷等密切相關。因此發(fā)展簡便、快速、超靈敏的miRNA檢測新方法具有十分重要的意義。本研究整合靶物質輔助的等溫指數擴增反應(EXPAR)及酶催化信號放大策略，以電化學生物傳感器為平臺，建立一種miRNA檢測新技術。靶miRNA與電極表面已修飾的模板DNA結合，作為引物觸發(fā)延伸反應形成雙鏈。

3、雙鏈中的其中一條鏈被限制性內切酶識別其特異位點并進行切割，釋放，繼續(xù)進行延伸反應。釋放出的DNA片段與靶miRNA有著相同的序列（T代替U），可與其余模板結合進行延伸，形成靶物質輔助的等溫指數擴增反應。電化學響應信號隨著靶miRNA濃度增加而減小。所建立的方法最低檢測限為98.9fM，其線性范圍為100fM到10nM。用電化學循環(huán)伏安法及阻抗譜來表征電極表面修飾過程。該傳感器能夠區(qū)分miRNA家族中單堿基錯配的成員。該方法有望用于實際樣

4、本中miRNA檢測，并在生物醫(yī)學研究及臨床診斷領域具有很大的應用潛力。
　　2.基于均相靶識別誘導原位轉錄擴增的電化學傳感技術超靈敏檢測核酸
　　以電化學傳感器為平臺，整合均相核酸轉錄、核酸等溫擴增技術及酶催化放大技術，建立一種基于均相靶識別誘導原位轉錄擴增技術的實用、準確、超靈敏的核酸檢測方法。在均相環(huán)境中，靶DNA與莖環(huán)探針結合使其打開，在引物、KF聚合酶、dNTPs存在的條件下進行循環(huán)鏈置換反應，延伸的DNA雙鏈含有T