手足口病常見病原體的實驗室診斷方法建立和初步臨床應(yīng)用.pdf

1、手足口病是一種病毒性傳染病,由腸道病毒引起的,主要的病原體是腸病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(Cox A16)。嬰幼兒及學(xué)齡前兒童易感。少部分的手足口病例可并發(fā)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,包括腦膜炎、病毒性腦炎、肢體麻痹等,甚至導(dǎo)致死亡。所以該病的早期診斷顯得非常重要。本研究擬建立手足口病的病毒核酸和血清抗體檢測方法,并對其進(jìn)行初步的臨床評價。
　　 目的：建立一種能同時檢測腸道病毒、腸道病毒71型乖柯薩奇病毒16型等手足口

2、病病原體核酸的實時熒光PCR方法；在原核表達(dá)系統(tǒng)中對腸道病毒71型基因進(jìn)行克隆、表達(dá)、純化,建立血清中IgM抗體的檢測方法；并進(jìn)一步評估人腸道病毒71型IgM抗體在手足口病早期診斷中的價值。
　　 方法：⑴根據(jù)腸道病、腸道病毒71型和柯薩奇病毒16型等手足口病病原體核酸的基因序列,設(shè)計、合成引物和探針,對38例手足口病患者在實時熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增、檢測和結(jié)果分析,并與常規(guī)RT—PCR方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比對。⑵采用RT—PCR

3、的方法,分離EV71 VP1基因；將該片段插入表達(dá)載體pRSET—A,在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),利用純化后的表達(dá)產(chǎn)物,建立檢測EV71 IgM抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗,對31例臨床診斷為手足口患兒及36例健康兒童血清進(jìn)行了檢測。⑶自發(fā)病后連續(xù)每日采集2010年我院收治的38例手足口病患兒血清及咽拭子標(biāo)本,分別檢測EV71 IgM抗體、腸道病毒核酸、EV71病毒核酸。
　　 結(jié)果：①38例患者腸道病毒、腸道病毒71型和柯薩奇病毒16型實

4、時熒光PCR方法陽性率分別為:73.7％,61.O％,13.2％,常規(guī)RT—PCR方法的陽性率分別為:71.1％,55.3％,13.2％。統(tǒng)計分析表明,實時熒光PCR方法與常規(guī)RT—PCR檢測結(jié)果差異不具統(tǒng)計學(xué)意義。②PCR產(chǎn)物及重組蛋白大小分別約為910bp及33KD,與預(yù)期VP1全基因及蛋白片段大小一致。ELISA檢測結(jié)果顯示在手足口患兒中有7例呈陽性,健康組中未發(fā)現(xiàn)陽性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。③38例手足口病患兒IgM抗體,按發(fā)病天

5、數(shù)累加陽性率分別為:第1天60.5％、第2天71.1％、第3—4天81.5％、第5天92.1％、第6天92.1％；腸道病毒核酸陽性率為73.6％；EV71特異核酸陽性率為60.5％。
　　 結(jié)論：⑴建立了實時熒光PCR檢測HFMD病原體EV71,COX A16、EV的方法,且該方法在對病毒核酸檢測的靈敏度與特異性方面與常規(guī)RT—PCR吻合度較高,兩種方法具有一致性。⑵成功建立了EV71 IgM抗體的檢測方法。⑶EV71 IgM抗