手足口病患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)、病原體分析及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.調(diào)查2015年4月-7月在鄭州市某兒童醫(yī)院住院的手足口病患者的臨床體征、實(shí)驗(yàn)室檢查資料，并比較分析輕、重癥患者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的差異，為臨床檢測(cè)患者的重癥化提供依據(jù)。
　　2.通過(guò)描述臨床分離的EV71病毒的病原體分子特征，并分析比較輕、重癥手足口病患者的EV71編碼區(qū)特征的差異性，從病原體的角度探討病原體引起手足口病重癥化的原因。
　　3.探討EV71感染RD細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的氧化應(yīng)激與細(xì)胞因子水平變化的關(guān)

2、系。
　　方法：
　　1.采用問(wèn)卷調(diào)查對(duì)187例手足口病患者的一般情況和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行收集，利用單因素及多因素分析輕、重癥手足口病患者差異分布的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。
　　2.從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收集經(jīng)全基因組測(cè)序的EV71病毒共748株，通過(guò)文獻(xiàn)檢索最終篩選有明確臨床特征的共230株。然后通過(guò)生物信息學(xué)軟件進(jìn)行230株EV71的分子特征分析，并進(jìn)行差異位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)分析和二級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)描述。
　　3.通過(guò)檢測(cè)比較E

3、V71感染RD細(xì)胞0h、12h、24h、48h后的細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平來(lái)判斷氧化應(yīng)激的發(fā)生，然后通過(guò)Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的磷酸化、未磷酸化NF-kappaB和IkBα的蛋白水平變化，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α等炎性因子的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.輕、重癥手足口病患兒的中性細(xì)胞比率、淋巴細(xì)胞比率、IgM、降鈣素原均隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化（P<0.05）；中性細(xì)胞比率（OR=1.198，P=0.001）

4、、淋巴細(xì)胞比率（OR=1.194，P=0.002）、白細(xì)胞個(gè)數(shù)（OR=0.916，P=0.024）、血清鈉離子（OR=0.690，P<0.001）是手足口病患兒重癥化結(jié)局的影響或預(yù)警實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。
　　2.共搜集到103株輕癥和127株重癥EV71型手足口病病人的病毒，以C4基因型為主，主要分布于亞太地區(qū)。分離于同一時(shí)間和地區(qū)的病毒之間的相似性較大，而分離于不同時(shí)間和地區(qū)的病毒相似性較小，遺傳距離較遠(yuǎn)。輕癥來(lái)源的EV71病毒之間的V

5、P1氨基酸序列同源性為96％-100%，重癥來(lái)源的病毒之間的VP1氨基酸序列同源性為94-100%，而輕癥和重癥來(lái)源的病毒之間同源性為92%-100%；輕、重癥病毒有41個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），P3蛋白區(qū)域變異最大，有26個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)（P<0.001）；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及非二級(jí)結(jié)構(gòu)分別有21和20個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)的分布，結(jié)構(gòu)域未見(jiàn)差異位點(diǎn)的分布。
　　3.EV71感染RD細(xì)胞24h、48h后與0h相比，

6、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；而且48h后NF-kappaB被激活轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)部的水平增加(P=0.0394).，與0h組即未感染空白對(duì)照組相比，感染12h、24h、48h后RD細(xì)胞中的IL-6細(xì)胞因子的水平均有明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).；感染48h后RD細(xì)胞中的TNF-α的水平相比較感染0h組有一定的升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，而感染12h、24h組與感染0h組的TNF-α水平