基于多重PCR的病原體檢測新技術(shù)的建立和應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　對于任何傳染性疾病的出現(xiàn)，能及時檢測和鑒定病原體是有效控制疫情并選擇合理治療方案的關(guān)鍵。隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，以核酸擴(kuò)增和核酸序列分析為代表的分子診斷/檢測技術(shù)在病原體鑒定和確認(rèn)中越來越多地發(fā)揮了重要作用。近年來突發(fā)公共衛(wèi)生事件處置中未知病原體大量篩查、臨床診斷中非特異癥狀相關(guān)的病因確定、個體化醫(yī)療中易感基因篩查等多樣化的實際需求又提出了對一份樣本中存在的多個靶標(biāo)進(jìn)行同步檢測的要求，即多重生物檢測。目前，常規(guī)多重檢測

2、存在通量不高和成本高（如多重定量PCR）或自動化程度不高（如多重PCR結(jié)合普通瓊脂糖凝膠電泳分析）的不足，因此，建立一種高靈敏度和特異性高通量和低成本的準(zhǔn)確鑒定病原及其突變的技術(shù)，對提高我國應(yīng)對突發(fā)傳染病的能力和控制傳染病的流行有重大意義。
　　目的：
　　建立基于熔解熔解曲線分析和QIAxcel毛細(xì)管電泳儀的兩種新型一步法多重PCR檢測技術(shù)。應(yīng)用熔解曲線分析多重PCR檢測技術(shù)可以在兩管中同時檢測六種常見的食源性細(xì)菌，包括:

3、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、李斯特氏菌和致瀉性大腸桿菌，四管中同時檢測十二種腹瀉病原體，包括:六種腹瀉病毒和六種腹瀉細(xì)菌，還可以結(jié)合ARMS-PCR對流感病毒耐藥位點(diǎn)進(jìn)行突變檢測。應(yīng)用QIAxcel毛細(xì)管電泳儀多重PCR檢測技術(shù)可以實現(xiàn)單管同時檢測六種人類冠狀病毒，包括:HCoV-NL63、HCoV-229E、SARS-CoV、 HCoV-OC43、MERS-CoV和HCoV-HKU1，兩管同時檢測十三種腹瀉病原體，

4、包括:六種腹瀉病毒和七種腹瀉細(xì)菌。本方法擬在全國省市疾控中心推廣應(yīng)用于常見食源性細(xì)菌、常見腹瀉病原體和人類冠狀病毒的常規(guī)監(jiān)測。
　　方法：
　　本研究建立的兩種檢測新技術(shù)分別應(yīng)用兩種不同的分析方法:基于熔解曲線分析和基于QIAxcel毛細(xì)管電泳儀分析方法。針對檢測病原體的保守區(qū)及部分病毒的分型區(qū)序列設(shè)計特異性引物，并對常見的細(xì)菌及病毒引物進(jìn)行驗證，熔解曲線分析技術(shù)的原理是在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入熒光染料，PCR擴(kuò)增結(jié)束后運(yùn)

5、行一步熔解曲線反應(yīng)程序。不同病原體DNA序列因其片段長度大小和GC含量的差異，熔解溫度Tm值會各不相同，即可通過不同熔解曲線區(qū)分不同的病原體擴(kuò)增片段。設(shè)計6對特異性引物于兩管內(nèi)擴(kuò)增檢測六種常見的食源性細(xì)菌;12對特異性引物于四管中擴(kuò)增檢測十三種腹瀉病原體;對流感病毒耐藥位點(diǎn)設(shè)計2對特異性引物結(jié)合ARMS-PCR檢測野生型和突變型兩種不同的基因型。QIAxcel毛細(xì)管電泳儀分析技術(shù)的原理是利用不同的擴(kuò)增片段大小進(jìn)行區(qū)分不同的病原體，因此設(shè)

6、計6對特異性引物于一管中檢測六種人類冠狀病毒，13對特異性引物于兩管中檢測十三種腹瀉病原體。評價兩種檢測新技術(shù)的靈敏度和特異性，運(yùn)用人工污染樣品或臨床樣品進(jìn)行實際驗證，并與實驗室常用檢測標(biāo)準(zhǔn)的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，檢測結(jié)果不一致的標(biāo)本用測序和另選取特異性檢測基因設(shè)計引物擴(kuò)增并測序的方法進(jìn)行再驗證，評價兩種檢測新技術(shù)的臨床運(yùn)用情況。
　　結(jié)果：
　　成功建立了一種基于熔解曲線分析的多重PCR檢測技術(shù)。
　　1.六種常見的食源

7、性細(xì)菌純培養(yǎng)中同時檢測出的靈敏度可以達(dá)到102CFU/ml，人工污染牛奶的實驗中六種病原體同時檢出的靈敏度可以達(dá)到105CFU/ml的水平。
　　2.十二種腹瀉病原體的檢測中多引物單模板和多引物多模板檢測六種腹瀉病毒的靈敏度均為50拷貝/反應(yīng)，六種腹瀉細(xì)菌的檢測靈敏度為140-500CFU/ml。122份臨床樣品的檢測結(jié)果與實驗室常用檢測標(biāo)準(zhǔn)的檢測結(jié)果比較顯示，四管多重法有5例輪狀病毒A型多檢，2例腺病毒F型多檢，1例諾如病毒Ⅰ型

8、漏檢。多檢樣品采取測序和另選取特異性檢測基因設(shè)計引物擴(kuò)增并測序的方法進(jìn)行再驗證后四管多重法結(jié)合熔解曲線檢測結(jié)果與測序相符合。
　　3.結(jié)合ARMS-PCR對流感病毒耐藥位點(diǎn)的檢測，多重檢測體系單模板檢測下限均可以達(dá)到1.0×102copy/μ l。多重檢測體系多模板在1.0×103copy/μl水平時可同時檢測到突變型和野生型兩種混合模板。
　　成功建立了一種基于QIAxcel毛細(xì)管電泳儀的多重PCR檢測技術(shù)。
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9、.六種人類冠狀病毒的檢測結(jié)果顯示一管多重檢測體系在檢測單個病毒時靈敏度能達(dá)到10-100 copy/μl。臨床樣本平行驗證結(jié)果與常用的單一HCoV檢測的熒光定量RT-PCR法及巢式PCR法一致。
　　2.十三種腹瀉病原體的檢測結(jié)果顯示兩管多重檢測體系與四管熔解曲線分析多重PCR檢測熔解結(jié)果比較除5例諾如病毒Ⅱ型漏檢外，其他檢測結(jié)果基本一致。
　　結(jié)論：
　　成功建立了基于熔解曲線分析和QIAxcel毛細(xì)管電泳儀分析的兩