莢膜組織胞漿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法的初步研究.pdf

1、目的： 莢膜組織胞漿菌病(HP)是一種烈性真菌傳染病，與肺結(jié)核等疾病難以鑒別，其嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，我國過去少見報(bào)道，現(xiàn)有增多趨勢(shì)，在國內(nèi)該病尚無系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法和標(biāo)準(zhǔn)。本研究擬研制莢膜組織胞漿菌病體內(nèi)診斷試劑莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物(P-HTPM)，并建立一套完整的包括莢膜組織胞漿菌病免疫學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，為今后的臨床研究提供檢驗(yàn)技術(shù)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 第一部分莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物

2、的制備首先進(jìn)行莢膜組織胞漿菌(HC)菌種的生物學(xué)特性研究，研究包括該菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性及抗原性等方面。采用自制液體培養(yǎng)基表面培養(yǎng)法培養(yǎng)HC，用弱酸和鹽析法從HC的培養(yǎng)液中提取和純化莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物(P-HTPM)，制備成實(shí)驗(yàn)所用P-HTPM原液，初步檢測(cè)P-HTPM對(duì)免疫豚鼠的皮膚效力試驗(yàn)。 第二部分莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物豚鼠皮膚試驗(yàn)P-HTPM作為遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)的變態(tài)反應(yīng)原，以國外參考

3、品HIMN(1:100莢膜組織胞漿菌素濾液制劑稀釋液)為對(duì)照，研究此蛋白制劑對(duì)莢膜組織胞漿菌致敏的豚鼠皮膚試驗(yàn)的效力和敏感性；分別以結(jié)核菌素純蛋白衍生物(TB-PPD)和卡介菌素純蛋白衍生物(PPD-B)為對(duì)照，探討P-HTPM與TB-PPD、PPD-B對(duì)莢膜組織胞漿菌致敏的豚鼠有無皮膚交叉反應(yīng)，以及用P-HTPM對(duì)皮炎芽生菌、副球孢子菌和馬爾尼菲青霉菌致敏的豚鼠進(jìn)行皮膚試驗(yàn)，確定P-HTPM作為體內(nèi)診斷制品的特異性。 第三部分

4、莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物為抗原的血清學(xué)診斷試驗(yàn)以P-HTPM為包被抗原，通過不同免疫次數(shù)獲得高效價(jià)和低效價(jià)免疫血清為抗體，探索各種最適血清學(xué)免疫試驗(yàn)方法的檢測(cè)條件，分別建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫膠體金層析試驗(yàn)(GICA)，檢測(cè)莢膜組織胞漿菌免疫血清，評(píng)估兩種方法的敏感性；分別以P-HTPM、TB-PPD、各種真菌及各種分枝桿菌的菌體上清液為包被抗原，ELISA檢測(cè)莢膜組織胞漿菌免疫血清，以及其它雙相型真菌、念珠菌、曲霉

5、菌免疫血清和多種分枝桿菌免疫血清，了解P-HTPM與這些真菌和分枝桿菌有無血清學(xué)交叉反應(yīng)，評(píng)估ELISA方法的特異性。以P-HTPM為包被抗原的GICA試紙條檢測(cè)HC、其它雙相型真菌、念珠菌、曲霉菌免疫血清和MTB免疫血清，評(píng)估GICA方法的特異性。 第四部分莢膜組織胞漿菌PCR測(cè)定針對(duì)莢膜組織胞漿菌的特異性抗原M蛋白的編碼基因設(shè)計(jì)引物，以莢膜組織胞漿菌培養(yǎng)物制備的eDNA為模板，檢定引物擴(kuò)增的特異性，分別以8×106CFU/m

6、l和8×100CFU/ml菌懸液的HC膜板為高濃度和低濃度膜板進(jìn)行擴(kuò)增，探索并優(yōu)化PCR體系中影響擴(kuò)增效果的緩沖液添加劑的有無、鎂離子濃度、引物濃度、退火溫度等重要因素。將梯度稀釋的菌懸液制備的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增確定其檢測(cè)敏感度；擴(kuò)增其他雙相型真菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)和鑒定莢膜組織胞漿菌的方法。同時(shí)與常規(guī)PCR法進(jìn)行比較，擴(kuò)增HC、其他雙相型真菌、常見深部感染之真菌，以及結(jié)核分枝桿菌和其他分枝桿菌的模板，采用電泳

7、分析其檢測(cè)的敏感性和特異性。 結(jié)果： 第一部分莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物的制備成功提取P-HTPM，該提取方法的蛋白產(chǎn)率為18.30±3.27mg/L；蛋白純度達(dá)85％，多糖含量13.16％，核酸含量0.88％；并能誘導(dǎo)致敏豚鼠的特異性皮膚反應(yīng)。 第二部分莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物豚鼠皮膚試驗(yàn)1.1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml的P-HTPM與國外參考品引起皮膚反應(yīng)的比值為0.9、1.0

8、、1.1和1.2，其2μg/ml的P-HTPM與國外參考品等效。 2.P-HTPM對(duì)HC致敏豚鼠皮膚反應(yīng)均為陽性，平均硬結(jié)直徑(11.2±1.0)mm；但對(duì)卡介苗、結(jié)核、牛、鳥、蟾蜍、土地、胃、不產(chǎn)色、施氏、次要、產(chǎn)鼻疽、堪薩斯、海、亞洲、瘰疬、戈登、蘇加、龜、偶發(fā)、恥垢、楚布、豬、母牛等分枝桿菌致敏的豚鼠均呈陰性反應(yīng)，硬結(jié)直徑均為0.0mm。 3.TB-PPD對(duì)結(jié)核分枝桿菌(MTB)致敏豚鼠皮膚反應(yīng)均為陽性，硬結(jié)直徑(

9、12.9±1.9)mm；但對(duì)HC致敏豚鼠皮膚反應(yīng)為陰性，硬結(jié)直徑均為0.0mm。PPD-B對(duì)牛、鳥、蟾蜍、土地、胃、不產(chǎn)色、施氏、次要、產(chǎn)鼻疽、堪薩斯、海、亞洲、瘰疬、戈登、蘇加、龜、偶發(fā)、恥垢、楚布、豬、母牛等分枝桿菌致敏的豚鼠皮試均為陽性；但對(duì)HC免疫豚鼠皮試為陰性。 第三部分莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物為抗原的血清學(xué)診斷試驗(yàn) 1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試驗(yàn)(ELISA) (1)確定P-HTPM最適工作濃度為1μg

10、/孔，小鼠HC免疫血清最適工作濃為為1:1000。 (2)P-HTPM為包被抗原的ELISA，檢測(cè)20份HC免疫血清，結(jié)果均為陽性，A值1.036±0.24；檢測(cè)MTB免疫血清、其他分枝桿菌免疫血清、念珠菌屬、曲菌屬和隱球菌屬免疫血清結(jié)果均為陰性，P＜0.01；檢測(cè)副球孢子菌免疫血清和馬爾尼菲青霉菌免疫血清，10份血清中分別出現(xiàn)8份陽性結(jié)果；檢測(cè)10份皮炎芽生菌免疫血清結(jié)果均為陽性，A值1.103±0.478，與HC免疫血清相比

11、，差異無顯著性意義(P＞0.05)。 (3)TB-PPD為包被抗原的ELISA檢測(cè)MTB免疫血清均為陽性，A值1.614±0.272；檢測(cè)HC免疫血清均為陰性，A值0.052±0.004，P＜0.01。PPD-B為包被抗原的ELISA檢測(cè)其他分枝桿菌免疫血清結(jié)果均為陽性，檢測(cè)HC免疫血清均為陰性。 (4)副球孢子菌和皮炎芽生菌為抗原的ELISA檢測(cè)HC免疫血清，出現(xiàn)陽性率分別為40％(4/10)、70％(7/10)，A值

12、分別為0.135±0.053、0.229±0.035；檢測(cè)兩種菌相應(yīng)的免疫血清結(jié)果均為陽性。而馬爾尼菲青霉菌為抗原的ELISA檢測(cè)HC免疫血清，結(jié)果卻全為陰性。 2.免疫膠體金層析試驗(yàn)(GICA) (1)P-HTPM最適噴膜濃度為2mg/ml，檢測(cè)HC免疫血清結(jié)果均為陽性，顯色好，能肉眼迅速區(qū)分出強(qiáng)陽性和弱陽性結(jié)果。 (2)終濃度為5mg/ml的BSA封閉抗原效果最好，10份陰性標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果全為陰性，9份陽性標(biāo)

13、本檢測(cè)結(jié)果未受到影響。而在0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml時(shí)陰性血清中2號(hào)標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果均為陽性。 (3)加入處理液稀釋待檢血清可提高檢出效果，以4:5稀釋血清效果最佳，待測(cè)液流動(dòng)快，C線和T線顯色均明顯，邊緣清晰，膜的背景干凈，更易于結(jié)果的準(zhǔn)確判斷。 (4)GICA檢測(cè)9份兔HC免疫血清和14份小鼠HC免疫血清均為陽性，陽性檢出率100％，與ELISA檢測(cè)結(jié)果相符合，符合率100％。強(qiáng)陽性標(biāo)本在1:4096稀

14、釋時(shí)仍能被檢出(+)，弱陽性標(biāo)本在1:512稀釋時(shí)仍能被檢出(±～+)，表明該GICA方法檢測(cè)靈敏度高。 (5)檢測(cè)16份小鼠結(jié)核分枝桿菌免疫血清，出現(xiàn)1份陽性；檢測(cè)常見念珠菌和曲霉菌免疫血清全為陰性結(jié)果；檢測(cè)皮炎芽生菌和副球孢子菌血清出現(xiàn)較高的陽性率，分別為86％(6/7)、40％(4/10)，與ELISA結(jié)果相符合；7份馬爾尼菲青霉菌血清檢測(cè)結(jié)果全為陰性，與ELISA結(jié)果不相符合。 第四部分莢膜組織胞漿菌PCR測(cè)定

15、 1.用真菌和分枝桿菌的通用引物常規(guī)PCR法分別擴(kuò)增各種膜板，均有陽性產(chǎn)物，表明試驗(yàn)所用各種膜板制備成功；引物D1D2能特異性地?cái)U(kuò)增莢膜組織胞漿菌，擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小為289bp，其序列在GenBank中比對(duì)，符合有性期的莢膜組織胞漿菌；擴(kuò)增其他雙相型真菌、念珠菌、曲霉菌、新生隱球菌和結(jié)核等分枝桿菌模板時(shí)，均無目的條帶出現(xiàn)，表明引物D1D2的特異性高。 2.實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)莢膜組織胞漿菌的最低量為8個(gè)真菌。 3

16、.實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中優(yōu)化條件如下：檢測(cè)低濃度模板時(shí)，加入適量甲酰胺的反應(yīng)液可明顯改善檢測(cè)結(jié)果。Mg2+＞5mmol/L時(shí)檢測(cè)效果較好，擴(kuò)增高濃度模板時(shí)Ct值為21.72±0.33，擴(kuò)增低濃度模板時(shí)Ct值為29.96±2.4。增加Taq酶的用量有利于PCR擴(kuò)增檢測(cè)；Cytech公司生產(chǎn)的。Taq酶檢測(cè)效果比其它兩個(gè)公司的好。引物濃度低時(shí)擴(kuò)增效果稍差，熒光響應(yīng)強(qiáng)度也較低；退火溫度為68℃、70℃、72℃時(shí)，對(duì)結(jié)果無太大影響。

17、 結(jié)論： 第一部分莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物的制備采用鹽析和弱酸相結(jié)合的方法從莢膜組織胞漿菌中提取莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物的工藝有效可行，蛋白純度高。 第二部分莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物豚鼠皮膚試驗(yàn) 第三部分莢膜組織胞漿菌素純蛋白衍生物為抗原的血清學(xué)診斷試驗(yàn) 第四部分莢膜組織胞漿菌PCR測(cè)定引物D1D2的PCR法檢測(cè)和鑒定莢膜組織胞漿菌的敏感性和特異性均高，能作為莢膜組織胞漿菌病快速、準(zhǔn)確的診斷