低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨溴索對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響及殺菌效果的研究.pdf

1、第一部分，低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨溴索對(duì)表葡葡萄球菌生物被膜殺菌效果的研究
　　[目的]建立聚乙烯材料表面表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)生物被膜(biofilm，BF)的體外模型，聯(lián)合低頻超聲和鹽酸氨溴索作用于成熟BF，定量分析低頻超聲增強(qiáng)鹽酸氨溴索對(duì)表皮葡萄球菌BF的殺菌效果。
　　[方法]于聚乙烯材料表面建立S.epidelmidis RP62A菌株的成熟BF模型，利用快速銀染法觀察和鑒定B

2、F結(jié)構(gòu)。分為7組，空白對(duì)照組，單獨(dú)低頻超聲干預(yù)組，單獨(dú)鹽酸氨溴索(濃度0.938、1.875 mg/ml)干預(yù)組，鹽酸氨溴索(濃度0.938、1.875mg/ml)+低頻超聲1 h組，鹽酸氨溴索(1.875 mg/ml)+低頻超聲0.5 h組，空白對(duì)照組只加TSB培養(yǎng)基，低頻超聲作用1 h，鹽酸氨溴索作用24 h。分組干預(yù)后，利用二甲氧唑黃比色法(XTT)結(jié)合BF內(nèi)的活菌，結(jié)合多功能酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，定量分析比較各不同干預(yù)組BF中細(xì)菌活

3、力變化。
　　[結(jié)果]RP62A菌株成熟BF快速銀染后，于光學(xué)顯微鏡下可見成熟BF結(jié)構(gòu)，細(xì)菌成團(tuán)黏附聚集，以絲狀胞外多糖EPS之間相互聯(lián)結(jié)。XTT法結(jié)果顯示空白對(duì)照組、單獨(dú)低頻超聲作用組OD450值分別為1.895±0.146、1.932±0.077(P>0.05)；單獨(dú)鹽酸氨溴索作用組，隨著氨溴索濃度的增加，OD450值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表示BF內(nèi)被檢出的具有活性的細(xì)菌逐漸下降，在氨溴索濃度達(dá)到1.875mg/ml時(shí)，OD450值為

4、0.472±0.056，與空白對(duì)照組(1.895±0.146)相比，P<0.05；鹽酸氨溴索(濃度1.875mg/ml)聯(lián)合不同作用時(shí)間(0.5 h和1 h)低頻超聲組OD450值分別為0.104±0.052、0.064±0.048，與單獨(dú)鹽酸氨溴索(濃度1.875mg/ml)作用組相比P<0.05，組間相比，P>0.05。
　　[結(jié)論]單獨(dú)低頻超聲對(duì)表皮葡萄球菌BF無清除作用，鹽酸氨溴索濃度達(dá)到1.875mg/ml時(shí)，能明顯殺滅

5、成熟表皮葡萄球菌BF內(nèi)的細(xì)菌，達(dá)到清除BF的效果，低頻超聲能明顯促進(jìn)鹽酸氨溴索對(duì)BF的作用，且聯(lián)合低頻超聲作用1 h和0.5 h組之間相比效果無明顯差異。
　　第二部分，低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨澳索對(duì)表葡葡萄球菌生物被膜結(jié)構(gòu)的影響
　　[目的]體外聚乙烯材料建立成熟表皮葡萄球菌BF，利用低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨溴索進(jìn)行干預(yù)，驗(yàn)證低頻超聲能夠促進(jìn)鹽酸氨溴索的效果，增強(qiáng)其對(duì)BF結(jié)構(gòu)的的破壞作用。
　　[方法]建立聚乙烯材料表面的表皮葡

6、萄球菌成熟BF體外模型，分為5組，空白對(duì)照組，單獨(dú)低頻超聲作用組，單獨(dú)鹽酸氨溴索(濃度1.875mg/ml)作用24 h組，鹽酸氨溴索(濃度1.875mg/ml)作用24 h+低頻超聲作用1 h組，鹽酸氨溴索(濃度1.875mg/ml)作用24 h+低頻超聲0.5 h組，SYT09/PI對(duì)BF內(nèi)細(xì)菌熒光染色后，于共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM)觀察，利用圖像結(jié)構(gòu)分析軟

7、件(Image Structure Analyzer，ISA)對(duì)各不同干預(yù)組BF圖像進(jìn)行結(jié)構(gòu)參數(shù)的定量分析，了解低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨溴索對(duì)表皮葡萄球菌BF結(jié)構(gòu)的影響；利用掃描電子顯微鏡(Scanning ElectronMicroscope，SEM)H5較各不同干預(yù)組BF結(jié)構(gòu)的變化。
　　[結(jié)果]CLSM掃描結(jié)果顯示單獨(dú)低頻超聲作用組紅綠熒光分布和強(qiáng)度和空白對(duì)照組無明顯差異，以綠色熒光(活菌)為主；單獨(dú)氨溴索(濃度1.875 mg/

8、ml)作用組紅色熒光信號(hào)(死菌)明顯增加，綠色熒光信號(hào)(活菌)分別和強(qiáng)度有減少，低頻超聲(1 h，0.5 h)能明顯促進(jìn)氨溴索對(duì)BF的清除作用，以紅色信號(hào)為主，滿布視野，僅少許散在分別綠色信號(hào)。結(jié)合ISA軟件定量分析各不同干預(yù)組BF結(jié)構(gòu)參數(shù)的區(qū)別，單獨(dú)氨溴索(濃度1.875 mg/ml)作用組和空白對(duì)照組相比，BF厚度分別為(15.45±2.48)μ m和(25.25±3.39)μ m，P<0.05；平均擴(kuò)散距離(average dif

9、fusion distance，ADD)分別為2.02±0.06和2.61±0.34，P<0.05；結(jié)構(gòu)熵(textual entropy，TE)分別為7.19±0.19和7.88±0.09，P<0.05；區(qū)域孔率(areal porosity，AP)分別為0.75±0.09和0.65±0.03，P<0.05。鹽酸氨溴索(濃度1.875 mg/ml)聯(lián)合低頻超聲(1 h，0.5 h)作用組的厚度(6.26±0.99，7.04±1.31)

10、μ m、AP分別為(0.90±0.01，0.85±0.03)、ADD分別為(1.53±0.03，1.52±0.05)、TE分別(5.68±0.07，5.82±0.52)，與單獨(dú)氨溴索(濃度1.875 mg/ml)作用組相比，P<0.05。SEM顯示，空白對(duì)照組與單獨(dú)氨溴索作用組BF清除效果不明顯，仍可見大量BF，低頻超聲聯(lián)合氨溴索作用的兩組可見BF被破壞明顯，原本復(fù)雜的立體三維結(jié)構(gòu)變得層數(shù)明顯減少，BF內(nèi)部的相互黏附和聚集的聯(lián)系被破壞，

11、間隙增大，變得松散，大部分細(xì)菌都是以游離狀態(tài)黏附于聚乙烯片表面。
　　[結(jié)論]低頻超聲能夠明顯促進(jìn)氨溴索(濃度1.875 mg/ml)對(duì)表皮葡萄球菌BF的清除作用，使得BF的結(jié)構(gòu)變得簡(jiǎn)單稀疏。
　　第三部分，低頻超聲聯(lián)合鹽酸氨溴索對(duì)表葡葡萄球菌生物被膜胞外多糖的作用
　　[目的]通過建立成熟表皮葡萄球菌BF模型，驗(yàn)證低頻超聲能夠促進(jìn)鹽酸氨溴索對(duì)BF胞外多糖的作用。
　　[方法]建立聚乙烯材料表面表皮葡萄球菌成熟B

12、F模型，分為5組，空白對(duì)照組，單獨(dú)低頻超聲作用組，單獨(dú)鹽酸氨溴索(濃度1.875mg/ml)作用24 h組，鹽酸氨溴索(濃度1.875mg/ml)作用24 h+低頻超聲作用1 h組，鹽酸氨溴索(濃度1.875mg/ml)作用24 h+低頻超聲0.5 h組，利用FITC-ConA對(duì)BF胞外多糖進(jìn)行染色；于熒光顯微鏡下觀察比較不同干預(yù)組熒光信號(hào)的強(qiáng)度和分布的區(qū)別，驗(yàn)證低頻超聲能夠增強(qiáng)氨溴索對(duì)S epidermidis BF胞外多糖的作用。<

13、br>　　[結(jié)果]熒光染色結(jié)果顯示，胞外多糖被FITC-ConA染色后呈綠色熒光，并包繞在細(xì)菌周圍，呈云絮狀分布，單獨(dú)氨溴索(濃度1.875mg/ml)作用組較空白對(duì)照組，能有效清除包繞在BF外的胞外多糖，綠色信號(hào)減弱，云絮狀物質(zhì)減少，而低頻超聲能明顯促進(jìn)氨溴索對(duì)胞外多糖的作用，使得顯微鏡下僅觀察到少許點(diǎn)狀熒光信號(hào)。
　　[結(jié)論]低頻超聲能夠明顯促進(jìn)氨溴索(濃度1.875 mg/ml)對(duì)表皮葡萄球菌BF胞外多糖的作用，使得BF結(jié)構(gòu)