表皮葡萄球菌基因組比較的生物學(xué)功能驗(yàn)證.pdf

1、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)是條件致病菌，寄居于人體的皮膚和粘膜表面，主要在體內(nèi)長(zhǎng)期留置導(dǎo)管(如中央靜脈插管、腹膜透析等)和接受人工器官(如人工關(guān)節(jié)、人工晶體和人工心臟瓣膜等)的患者中引起感染。近年來(lái)，其發(fā)病率呈日益上升的趨勢(shì)?，F(xiàn)已知道，表皮葡萄球菌的致病性與其在人造高分子材料表面形成細(xì)菌生物膜(biofilm，BF)密切相關(guān)，生物膜可以保護(hù)內(nèi)部的細(xì)菌免受機(jī)體免疫應(yīng)答和抗生素的殺傷作用，從而使得感染

2、遷延不愈。本研究以具有不同生物膜表型和致病能力的2株表皮葡萄球菌為基礎(chǔ)，采用生物信息學(xué)對(duì)基因組進(jìn)行了比較分析并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行生物學(xué)功能驗(yàn)證；同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)組比較中TRAP表達(dá)差異的結(jié)果進(jìn)行了生物學(xué)驗(yàn)證，并對(duì)trap基因表達(dá)與表皮葡萄球菌生物膜形成及附屬基因調(diào)節(jié)(agr)系統(tǒng)活化的相關(guān)性展開(kāi)研究；對(duì)葡萄球菌雙組分系統(tǒng)進(jìn)行了初步的探討，并選取srrB/srrA雙組分系統(tǒng)作為研究對(duì)象進(jìn)行初步研究。 第一部分表皮葡萄球菌基因組比較的生物學(xué)

3、功能驗(yàn)證 在表皮葡萄球菌ATCC12228株(無(wú)生物膜形成)和ATCC35984株(生物膜形成強(qiáng)陽(yáng)性)全基因組序列已知的基礎(chǔ)上，我們與上海市生物信息中心合作對(duì)2株菌進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析。分析結(jié)果顯示兩株菌的染色體DNA同源性很高(97﹪)，ATCC35984株基因組中含有較多的重復(fù)序列和插入序列，提示穩(wěn)定性較差。兩株菌染色體之間存在約2.0Mb基因片斷的反轉(zhuǎn)，伴有部分基因的缺失，并含有10,297個(gè)單核苷酸多態(tài)性(Single

4、-nucleotidepolymorphisms，SNPs)位點(diǎn)。特異性的PCR擴(kuò)增和測(cè)序結(jié)果證明基因組分析的正確性。毒力因子分析顯示ATCC12228株與ATCC35984株含有相似數(shù)目的致病基因，但生物學(xué)實(shí)驗(yàn)提示ATCC12228株的部分致病基因(AAP、TRAP、β毒素和δ毒素)在表達(dá)水平明顯低于ATCC35984株，可能與致病性的差異相關(guān)?？股啬退幍膶?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ATCC35984株對(duì)青霉素、苯唑西林、紅霉素、慶大霉素和阿米卡

5、星等多種抗生素耐藥，而ATCC12228株僅對(duì)青霉素和四環(huán)素耐藥，與分析結(jié)果相符。 對(duì)SNPs位點(diǎn)引起的非同義(non-synonymous，基因突變改變編碼蛋白的性狀)突變與同義突變(synonymous，基因突變不改變編碼蛋白的性狀)比值(N/S)的研究顯示毒力因子和表面蛋白基因的N/S比值明顯偏離總體基因的比值，提示兩者的進(jìn)化較快，平行于致病環(huán)境的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明非同義突變對(duì)部分基因產(chǎn)物的功能產(chǎn)生了影響：對(duì)甲硫氨酸亞砜還

6、原酶的功能影響通過(guò)檢測(cè)細(xì)菌對(duì)H2O2和paraquat(百草枯)等活性氧族(ReactiveOxygenSpecies，ROS)的抵抗力反映，結(jié)果顯示不管是在不同濃度的H2O2還是在低于MIC(minimalinhibitoryconcentration，最小抑菌濃度)的百草枯作用下，ATCC35984株的抵抗力均較強(qiáng)；對(duì)核糖體蛋白S12的功能影響通過(guò)在低濃度鏈霉素作用下細(xì)菌形態(tài)的變化進(jìn)行觀察，革蘭染色結(jié)果顯示加入低濃度鏈霉素后ATCC

7、12228株的顏色略偏紅色，并且細(xì)胞邊緣模糊，而ATCC35984株則無(wú)明顯變化。這些蛋白的功能變化雖然與ATCC35984株生物膜的形成沒(méi)有直接相關(guān)性，但對(duì)其致病力產(chǎn)生了重要的影響。此部分的研究結(jié)果提示由于致病環(huán)境的變化，使得ATCC35984株基因組在進(jìn)化過(guò)程中獲得了較多的致病性相關(guān)基因，從而具有較強(qiáng)的致病能力，并且這種進(jìn)化目前仍在繼續(xù)。 第二部分trap基因表達(dá)與表皮葡萄球菌生物膜形成及附屬基因調(diào)節(jié)(agr)系統(tǒng)活化的相關(guān)

8、性 對(duì)表皮葡萄球菌ATCC35984株和ATCC12228株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的蛋白進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)TRAP蛋白(TargetofRNAⅢ-activatingprotein，RNAⅢ活化蛋白的靶蛋白)表達(dá)存在差異。在金黃色葡萄球菌中TRAP是一個(gè)毒力和生物膜形成的調(diào)控因子，并且也是agr系統(tǒng)活化必需的通路蛋白，但在表皮葡萄球菌中尚未見(jiàn)研究報(bào)道。 我們采用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)表皮葡萄球菌臨床株(4株生物膜陽(yáng)性菌株和3株陰性菌株)tra

9、p基因和RNAⅢ(agr系統(tǒng)的效應(yīng)子)的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行研究，并以SEl457△agr(agr系統(tǒng)突變株)作為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示2株生物膜陽(yáng)性株trap基因的轉(zhuǎn)錄降低(與ATCC35984株相比分別降至0.029倍和0.322倍，p＜O.05)，而RNAⅢ轉(zhuǎn)錄未見(jiàn)降低，并且存在trap基因轉(zhuǎn)錄下降而RNAⅢ轉(zhuǎn)錄上升的現(xiàn)象(trap轉(zhuǎn)錄降至0.322倍，RNAIII轉(zhuǎn)錄增至4.001倍)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示在表皮葡萄球菌中，trap基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯

10、與生物膜形成及agr系統(tǒng)活化之間不存在一個(gè)直接的相關(guān)性。對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期trap基因和RNAⅢ轉(zhuǎn)錄水平的研究顯示，RNAⅢ的轉(zhuǎn)錄隨著細(xì)菌的增多而逐漸增加(熒光比值從2.83，9.05增至12.30)，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期達(dá)到最高，而trap基因的轉(zhuǎn)錄在各個(gè)時(shí)期均較低。對(duì)TRAP蛋白的同源性分析顯示其是葡萄球菌的保守性蛋白，但表皮葡萄球菌與金黃色葡萄球菌TRAP蛋白序列之間存在一個(gè)氨基酸的移位，從進(jìn)化樹(shù)(phylogenictree)中也可以看出

11、兩個(gè)菌種之間存在明顯的進(jìn)化距離，提示可能是兩者功能差異的原因。 第三部分葡萄球菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析 鑒于雙組分調(diào)控系統(tǒng)(Two-componentsystem，TCS)對(duì)葡萄球菌重要的調(diào)控作用，我們對(duì)葡萄球菌的雙組分系統(tǒng)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。在所研究的8株葡萄球菌基因組中(6株金黃色葡萄球菌和2株表皮葡萄球菌)均存在16或17對(duì)雙組分系統(tǒng)，這些雙組分系統(tǒng)的G+C含量與基因組相近，在基因組中均勻分布，參與調(diào)控多

12、種重要的生物功能。對(duì)雙組分系統(tǒng)組氨酸蛋白激酶(histidinekinase，HK)和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(responseregulator，RR)的功能域進(jìn)行分析，得到了4組HK和5組RR。HATPasec功能域和REC功能域分別是葡萄球菌HK和RR的標(biāo)志，其余HisKA、PAS、HAMP、GAF、KDP、5TM-5TMRLYT和各類(lèi)DNA結(jié)合功能域也存在于葡萄球菌的HK和RR中。對(duì)葡萄球菌HK進(jìn)一步根據(jù)ForstS提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)

13、可以歸為Ⅰ-Ⅳ類(lèi)(無(wú)CheA類(lèi))，Ⅰ類(lèi)是最主要的一類(lèi)，與其他革蘭陽(yáng)性菌的觀察結(jié)果相符。在葡萄球菌RR中，3個(gè)保守性殘基Asp、Gly和Lys的同源性較高，存在于所有RR中。金黃色葡萄球菌典型雙組分系統(tǒng)與主要毒力因子關(guān)系示意圖顯示其可以對(duì)多種毒力因子發(fā)揮調(diào)控作用，組成了復(fù)雜的交互調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。但是在表皮葡萄球菌中對(duì)此研究較少，值得我們進(jìn)一步探討。 第四部分表皮葡萄球菌srrB/srrA雙組分調(diào)控系統(tǒng)的研究 根據(jù)上述對(duì)雙組分系統(tǒng)

14、的分析得知在金黃色葡萄球菌中srrB/srrA(staphylococcalrespiratoryresponse)雙組分系統(tǒng)的作用是調(diào)節(jié)毒力因子分泌和呼吸代謝，因此我們選擇在表皮葡萄球菌中對(duì)srrB/srrA進(jìn)行研究，希望可以通過(guò)序列的分析和缺失突變株的構(gòu)建而研究其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及對(duì)細(xì)菌表型的影響。 對(duì)表皮葡萄球菌1457株srrA和srrB基因的分析顯示其與金黃色葡萄球菌同源性很高，分別為90﹪和69.9﹪。通過(guò)基因序列和位黃的

15、比較確定了表皮葡萄球菌srrA基因的TATA盒、RBS(Ribosomebindingsequence，核糖體結(jié)合序列)以及srrB基因的RBS。對(duì)SRRA和SRRB蛋白的功能域分析發(fā)現(xiàn)兩者均具有雙組分系統(tǒng)典型的功能域。并且在轉(zhuǎn)錄水平上也檢測(cè)到了轉(zhuǎn)錄活性。但是在構(gòu)建srrB/srrA缺失突變株卻未獲得成功，所得到23個(gè)重組抗性突變株并不是在目的基因srrA和srrB處發(fā)生同源重組。失敗的原因可能是基因組中較多重復(fù)序列(repeat)的干