Urocortin抑制饑餓誘導的乳腺癌細胞自噬及其機制研究.pdf

1、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin-releasing factor，CRF)家族肽包括4個成員，即CRF，Urocortin(Ucn)，Urocortin2(Ucn2)和Urocortin3(Ucn3)。CRF家族肽廣泛地分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周系統(tǒng)。CRF家族肽通過CRF1型受體(CRF receptor type1，CRFR1)和CRF2型受體(CRF receptor type2，CRFR2)調(diào)節(jié)多種類型細胞的

2、遷移、增殖和凋亡，這兩種亞型受體都屬于G蛋白偶聯(lián)受體。Ucn是一個由40個氨基酸組成的多肽。有研究表明，在缺血再灌注的心肌細胞中，Ucn通過抑制Beclin1的表達從而抑制自噬。然而，Ucn對人乳腺癌細胞自噬的作用及其機制尚無報道。
　　在正常情況下細胞的基礎(chǔ)自噬水平很低，因此本部分使用Earle's平衡鹽緩沖液(Earle's balanced salt solution，EBSS)饑餓誘導細胞發(fā)生自噬。然后，通過透射電子顯微鏡

3、(TEM)觀察自噬體從而檢測細胞的自噬活性。TEM結(jié)果顯示，EBSS饑餓的細胞中形成了雙層膜的自噬性囊泡，表明EBSS能誘導細胞發(fā)生自噬。此外，通過檢測構(gòu)成自噬體的重要成分P62（P62/sequestosome-1，一種泛素樣結(jié)合蛋白）和微管相關(guān)輕鏈蛋白3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)的表達水平從而衡量細胞的自噬活性。本實驗的研究對象為人乳腺癌細胞系（MDA-MB-

4、231和MCF-7細胞）。
　　本部分主要研究了Ucn對饑餓誘導的乳腺癌細胞自噬的作用及其相關(guān)機制。蛋白免疫印跡和慢病毒GFP-LC3轉(zhuǎn)染的結(jié)果表明，在饑餓誘導的乳腺癌細胞自噬中，Ucn升高了P62蛋白的水平，然而降低了LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值和GFP-LC3斑點的數(shù)量。為了明確Ucn是否通過CRF受體影響自噬，本實驗使用了非選擇性CRF受體阻斷劑Astressin(Ast)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ast阻斷了Ucn對饑餓誘導自噬的作用

5、，這表明Ucn是通過CRF受體發(fā)揮對細胞自噬的抑制作用。
　　接下來，本部分進一步探究Ucn降低LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值的原因，眾所周知，自噬體的形成和溶酶體的降解都能影響LC3B-Ⅱ水平的變化。因此有必要弄清Ucn降低LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值是由于Ucn減少了自噬體的形成，還是由于Ucn增加了自噬體的降解。實驗中使用了自噬溶酶體抑制劑巴弗洛霉素A1(BafilomycinA1，BafA1)，單獨給予BafA1明顯地增

6、加了GFP-LC3斑點的數(shù)量;與單獨給予BafA1相比，聯(lián)合給予Ucn和BafA1則顯著地減少了GFP-LC3斑點的數(shù)量。這些結(jié)果表明:Ucn是通過減少自噬體的形成從而降低LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值。此外，由于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin，mTOR)激酶是自噬過程中的一個重要的調(diào)控因子，因此，本部分進一步研究了Ucn對mTOR磷酸化水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ucn幾乎不影響兩種乳腺癌細