Urocortin抑制饑餓誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞自噬及其機(jī)制研究.pdf

1、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropin-releasing factor，CRF)家族肽包括4個(gè)成員，即CRF，Urocortin(Ucn)，Urocortin2(Ucn2)和Urocortin3(Ucn3)。CRF家族肽廣泛地分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周系統(tǒng)。CRF家族肽通過(guò)CRF1型受體(CRF receptor type1，CRFR1)和CRF2型受體(CRF receptor type2，CRFR2)調(diào)節(jié)多種類型細(xì)胞的

2、遷移、增殖和凋亡，這兩種亞型受體都屬于G蛋白偶聯(lián)受體。Ucn是一個(gè)由40個(gè)氨基酸組成的多肽。有研究表明，在缺血再灌注的心肌細(xì)胞中，Ucn通過(guò)抑制Beclin1的表達(dá)從而抑制自噬。然而，Ucn對(duì)人乳腺癌細(xì)胞自噬的作用及其機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。
　　在正常情況下細(xì)胞的基礎(chǔ)自噬水平很低，因此本部分使用Earle's平衡鹽緩沖液(Earle's balanced salt solution，EBSS)饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。然后，通過(guò)透射電子顯微鏡

3、(TEM)觀察自噬體從而檢測(cè)細(xì)胞的自噬活性。TEM結(jié)果顯示，EBSS饑餓的細(xì)胞中形成了雙層膜的自噬性囊泡，表明EBSS能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。此外，通過(guò)檢測(cè)構(gòu)成自噬體的重要成分P62（P62/sequestosome-1，一種泛素樣結(jié)合蛋白）和微管相關(guān)輕鏈蛋白3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)的表達(dá)水平從而衡量細(xì)胞的自噬活性。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象為人乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-

4、231和MCF-7細(xì)胞）。
　　本部分主要研究了Ucn對(duì)饑餓誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞自噬的作用及其相關(guān)機(jī)制。蛋白免疫印跡和慢病毒GFP-LC3轉(zhuǎn)染的結(jié)果表明，在饑餓誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞自噬中，Ucn升高了P62蛋白的水平，然而降低了LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值和GFP-LC3斑點(diǎn)的數(shù)量。為了明確Ucn是否通過(guò)CRF受體影響自噬，本實(shí)驗(yàn)使用了非選擇性CRF受體阻斷劑Astressin(Ast)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ast阻斷了Ucn對(duì)饑餓誘導(dǎo)自噬的作用

5、，這表明Ucn是通過(guò)CRF受體發(fā)揮對(duì)細(xì)胞自噬的抑制作用。
　　接下來(lái)，本部分進(jìn)一步探究Ucn降低LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值的原因，眾所周知，自噬體的形成和溶酶體的降解都能影響LC3B-Ⅱ水平的變化。因此有必要弄清Ucn降低LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值是由于Ucn減少了自噬體的形成，還是由于Ucn增加了自噬體的降解。實(shí)驗(yàn)中使用了自噬溶酶體抑制劑巴弗洛霉素A1(BafilomycinA1，BafA1)，單獨(dú)給予BafA1明顯地增

6、加了GFP-LC3斑點(diǎn)的數(shù)量;與單獨(dú)給予BafA1相比，聯(lián)合給予Ucn和BafA1則顯著地減少了GFP-LC3斑點(diǎn)的數(shù)量。這些結(jié)果表明:Ucn是通過(guò)減少自噬體的形成從而降低LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值。此外，由于哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin，mTOR)激酶是自噬過(guò)程中的一個(gè)重要的調(diào)控因子，因此，本部分進(jìn)一步研究了Ucn對(duì)mTOR磷酸化水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ucn幾乎不影響兩種乳腺癌細(xì)