長(zhǎng)春西汀誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、背景與研究目的:
　　乳腺癌是發(fā)生于乳腺小葉或?qū)Ч苌掀さ膼盒阅[瘤，是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占各種惡性腫瘤的7~10％。因此，世界眾多學(xué)者對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展以及治療和預(yù)后做了大量的研究。
　　眾所周知，乳腺癌發(fā)生的主要原因是乳腺上皮細(xì)胞或乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期失調(diào)后導(dǎo)致的細(xì)胞無限增殖。因此明確乳腺癌前體細(xì)胞和癌細(xì)胞的細(xì)胞周期運(yùn)行和調(diào)節(jié)的差異對(duì)于乳腺癌的治療具有重要意義。抑制細(xì)胞增殖促使細(xì)胞凋亡是當(dāng)今治療癌癥的主要思

2、想。凋亡的調(diào)節(jié)和執(zhí)行異?？蓪?dǎo)致腫瘤的發(fā)生，進(jìn)展、以及治療預(yù)后等。因此我們觀察了長(zhǎng)春西汀對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　長(zhǎng)春西汀(vinpocetine)為腦血管擴(kuò)張藥，能夠抑制磷酸二酯酶活性，增加血管平滑肌松弛信使 cGMP的活性，抑制Na+離子通道和Ca2+離子通道。已有文獻(xiàn)報(bào)道長(zhǎng)春西汀能抑制 PDE的活性，另有文獻(xiàn)報(bào)道使用PDE抑制劑IC86340敲除 PDE后，血管平滑肌細(xì)胞增殖受到抑制。我們觀察了乳腺癌細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)

3、長(zhǎng)春西汀能抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。因此在國(guó)家自然科學(xué)基金(NO.30900530)的資助下，本課題開展了該藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)及其相關(guān)機(jī)制研究。
　　方法與結(jié)果:
　　第一部分、長(zhǎng)春西汀抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡
　　1．長(zhǎng)春西汀對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響
　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們用CCK-8法觀察了長(zhǎng)春西汀對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，用PI染核流式細(xì)胞儀觀察了長(zhǎng)春西汀對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期的影響，并

4、用WB檢測(cè)了長(zhǎng)春西汀對(duì)周期相關(guān)蛋白Cyclin D、Cyclin E、P16INK4a的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1)CCK-8法結(jié)果表明長(zhǎng)春西汀濃度依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。
　　2)PI染核流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)春西汀濃度依賴性使MDA-MB-231細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G1期，同時(shí)出現(xiàn)了凋亡。并進(jìn)一步用MCF-7細(xì)胞驗(yàn)證了以上結(jié)果。
　　3)WB結(jié)果顯示長(zhǎng)春西汀處理乳腺癌24h后，Cyclin D、Cycli

5、n E蛋白的表達(dá)下調(diào)，P16INK4a蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　2．長(zhǎng)春西汀對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響
　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過Annexin V和PI雙染、Hoechst33258染核、JC-1探針測(cè)線粒體膜電位的方法觀察長(zhǎng)春西汀對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響，并用WB進(jìn)一步檢測(cè)了Caspase的活性、Bcl-2和Bax的表達(dá)變化以及Cyt. C的變化。
　　結(jié)果：
　　1)通過Annexin V和PI雙染結(jié)果顯示長(zhǎng)春西汀能誘導(dǎo)

6、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。同時(shí)，我們檢測(cè)了30μM長(zhǎng)春西汀處理后ZR-75-1細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞，結(jié)果同樣顯示凋亡增加。
　　2)通過Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。我們發(fā)現(xiàn)Hoechst33258染色后出現(xiàn)了細(xì)胞皺縮、核染色質(zhì)濃縮和凋亡小體。
　　3)JC-1探針測(cè)線粒體膜電位顯示，長(zhǎng)春西汀能使乳腺癌細(xì)胞線粒體降低。Western Blot結(jié)果顯示長(zhǎng)春西汀抑制了Bcl-2的表達(dá)，并且使線粒體Ba

7、x發(fā)生轉(zhuǎn)位，誘使線粒體cytochrome c釋放至胞漿且促使caspase-3,8,9的活性增加。
　　3.長(zhǎng)春西汀抑制乳腺癌細(xì)胞遷移
　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們用Transwell小室實(shí)驗(yàn)(transwell migration assay)觀察(15,30,60μM)長(zhǎng)春西汀對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明長(zhǎng)春西汀能濃度依賴性的抑制乳腺癌細(xì)胞遷移。
　　4.長(zhǎng)春西汀對(duì)Akt/STAT3/MAPKs信號(hào)的影響
　　

8、為進(jìn)一步研究長(zhǎng)春西汀阻滯細(xì)胞周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，我們通過Western Blot檢測(cè)了長(zhǎng)春西汀對(duì)Akt/STAT3/MAPKs信號(hào)通路的影響。
　　我們發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)春西汀能明顯抑制p-Akt、p-Stat3的表達(dá)，但對(duì)p-ERK、p-JNK、p-p38的表達(dá)沒有影響，這給我們提示長(zhǎng)春西汀可能通過抑制抑制p-Akt、p-Stat3的表達(dá)來阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞遷移的，但不影響MAPkinases。

9、>　　小結(jié)：
　　1)長(zhǎng)春西汀可能通過下調(diào)CyclinD、CyclinE，上調(diào)P16蛋白表達(dá)使乳腺癌細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞增殖。
　　2)長(zhǎng)春西汀處理乳腺癌細(xì)胞能下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)cytochrome c由線粒體釋放至胞漿，降低乳腺癌細(xì)胞線粒體的膜電位，最終激活 caspase-3,8,9這提示長(zhǎng)春西汀可能激活了細(xì)胞線粒體凋亡途徑和死亡配體途徑。
　　3)長(zhǎng)春西汀能濃度依賴性的抑制乳腺癌細(xì)胞遷移。

10、>　　4)長(zhǎng)春西汀可能通過抑制抑制Akt/STAT3信號(hào)通路來阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞遷移。
　　第二部分、長(zhǎng)春西汀對(duì)乳腺癌裸鼠移植瘤的瘤體的影響
　　方法：
　　為進(jìn)一步觀察長(zhǎng)春西汀對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響，我們采用了乳腺癌裸鼠移植瘤模型，觀察長(zhǎng)春西汀對(duì)瘤體增殖的影響。我們用游標(biāo)卡尺每三天測(cè)量一次瘤體體積，并用電子天平測(cè)量裸鼠體重的差異；進(jìn)一步取瘤體組織切片，TUNEL染色，熒光顯微鏡下觀察長(zhǎng)春西汀對(duì)瘤體組織凋

11、亡的影響；并用免疫熒光法檢測(cè)瘤體組織中p-Akt、p-Stat3表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1)長(zhǎng)春西汀能阻滯乳腺癌瘤體的生長(zhǎng)。
　　2)取裸鼠腫瘤切片，熒光顯微鏡下觀察到長(zhǎng)春西汀能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　3)取裸鼠腫瘤切片，免疫熒光檢測(cè)觀察到長(zhǎng)春西汀能降低p-STAT3/p-Akt的表達(dá)。
　　小結(jié)：
　　1)長(zhǎng)春西汀抑制乳腺癌瘤體增長(zhǎng)并誘導(dǎo)乳腺癌組織的凋亡。
　　2)長(zhǎng)春西汀能降低瘤體組織