長春西汀誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡及其機制研究.pdf

1、背景與研究目的:
　　乳腺癌是發(fā)生于乳腺小葉或?qū)Ч苌掀さ膼盒阅[瘤，是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占各種惡性腫瘤的7~10％。因此，世界眾多學(xué)者對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展以及治療和預(yù)后做了大量的研究。
　　眾所周知，乳腺癌發(fā)生的主要原因是乳腺上皮細胞或乳腺導(dǎo)管上皮細胞的細胞周期失調(diào)后導(dǎo)致的細胞無限增殖。因此明確乳腺癌前體細胞和癌細胞的細胞周期運行和調(diào)節(jié)的差異對于乳腺癌的治療具有重要意義。抑制細胞增殖促使細胞凋亡是當今治療癌癥的主要思

2、想。凋亡的調(diào)節(jié)和執(zhí)行異?？蓪?dǎo)致腫瘤的發(fā)生，進展、以及治療預(yù)后等。因此我們觀察了長春西汀對乳腺癌細胞周期和凋亡的影響。
　　長春西汀(vinpocetine)為腦血管擴張藥，能夠抑制磷酸二酯酶活性，增加血管平滑肌松弛信使 cGMP的活性，抑制Na+離子通道和Ca2+離子通道。已有文獻報道長春西汀能抑制 PDE的活性，另有文獻報道使用PDE抑制劑IC86340敲除 PDE后，血管平滑肌細胞增殖受到抑制。我們觀察了乳腺癌細胞的影響，發(fā)現(xiàn)

3、長春西汀能抑制乳腺癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。因此在國家自然科學(xué)基金(NO.30900530)的資助下，本課題開展了該藥對乳腺癌細胞抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的實驗及其相關(guān)機制研究。
　　方法與結(jié)果:
　　第一部分、長春西汀抑制乳腺癌細胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡
　　1．長春西汀對乳腺癌細胞周期的影響
　　在本實驗中，我們用CCK-8法觀察了長春西汀對乳腺癌細胞增殖的影響，用PI染核流式細胞儀觀察了長春西汀對乳腺癌細胞周期的影響，并

4、用WB檢測了長春西汀對周期相關(guān)蛋白Cyclin D、Cyclin E、P16INK4a的表達變化。
　　結(jié)果：
　　1)CCK-8法結(jié)果表明長春西汀濃度依賴性抑制乳腺癌細胞增殖。
　　2)PI染核流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)長春西汀濃度依賴性使MDA-MB-231細胞的細胞周期阻滯在G1期，同時出現(xiàn)了凋亡。并進一步用MCF-7細胞驗證了以上結(jié)果。
　　3)WB結(jié)果顯示長春西汀處理乳腺癌24h后，Cyclin D、Cycli

5、n E蛋白的表達下調(diào)，P16INK4a蛋白表達上調(diào)。
　　2．長春西汀對乳腺癌細胞凋亡的影響
　　在本實驗中，我們通過Annexin V和PI雙染、Hoechst33258染核、JC-1探針測線粒體膜電位的方法觀察長春西汀對乳腺癌細胞凋亡的影響，并用WB進一步檢測了Caspase的活性、Bcl-2和Bax的表達變化以及Cyt. C的變化。
　　結(jié)果：
　　1)通過Annexin V和PI雙染結(jié)果顯示長春西汀能誘導(dǎo)

6、MDA-MB-231細胞凋亡。同時，我們檢測了30μM長春西汀處理后ZR-75-1細胞和MCF-7細胞，結(jié)果同樣顯示凋亡增加。
　　2)通過Hoechst33258染色觀察細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。我們發(fā)現(xiàn)Hoechst33258染色后出現(xiàn)了細胞皺縮、核染色質(zhì)濃縮和凋亡小體。
　　3)JC-1探針測線粒體膜電位顯示，長春西汀能使乳腺癌細胞線粒體降低。Western Blot結(jié)果顯示長春西汀抑制了Bcl-2的表達，并且使線粒體Ba

7、x發(fā)生轉(zhuǎn)位，誘使線粒體cytochrome c釋放至胞漿且促使caspase-3,8,9的活性增加。
　　3.長春西汀抑制乳腺癌細胞遷移
　　在本實驗中，我們用Transwell小室實驗(transwell migration assay)觀察(15,30,60μM)長春西汀對乳腺癌細胞遷移的影響。結(jié)果表明長春西汀能濃度依賴性的抑制乳腺癌細胞遷移。
　　4.長春西汀對Akt/STAT3/MAPKs信號的影響
　　

8、為進一步研究長春西汀阻滯細胞周期誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制細胞遷移的分子機制，我們通過Western Blot檢測了長春西汀對Akt/STAT3/MAPKs信號通路的影響。
　　我們發(fā)現(xiàn)長春西汀能明顯抑制p-Akt、p-Stat3的表達，但對p-ERK、p-JNK、p-p38的表達沒有影響，這給我們提示長春西汀可能通過抑制抑制p-Akt、p-Stat3的表達來阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制細胞遷移的，但不影響MAPkinases。

9、>　　小結(jié)：
　　1)長春西汀可能通過下調(diào)CyclinD、CyclinE，上調(diào)P16蛋白表達使乳腺癌細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞增殖。
　　2)長春西汀處理乳腺癌細胞能下調(diào)Bcl-2的表達，促進cytochrome c由線粒體釋放至胞漿，降低乳腺癌細胞線粒體的膜電位，最終激活 caspase-3,8,9這提示長春西汀可能激活了細胞線粒體凋亡途徑和死亡配體途徑。
　　3)長春西汀能濃度依賴性的抑制乳腺癌細胞遷移。

10、>　　4)長春西汀可能通過抑制抑制Akt/STAT3信號通路來阻滯細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制細胞遷移。
　　第二部分、長春西汀對乳腺癌裸鼠移植瘤的瘤體的影響
　　方法：
　　為進一步觀察長春西汀對乳腺癌細胞的影響，我們采用了乳腺癌裸鼠移植瘤模型，觀察長春西汀對瘤體增殖的影響。我們用游標卡尺每三天測量一次瘤體體積，并用電子天平測量裸鼠體重的差異；進一步取瘤體組織切片，TUNEL染色，熒光顯微鏡下觀察長春西汀對瘤體組織凋

11、亡的影響；并用免疫熒光法檢測瘤體組織中p-Akt、p-Stat3表達的變化。
　　結(jié)果:
　　1)長春西汀能阻滯乳腺癌瘤體的生長。
　　2)取裸鼠腫瘤切片，熒光顯微鏡下觀察到長春西汀能促進腫瘤細胞凋亡。
　　3)取裸鼠腫瘤切片，免疫熒光檢測觀察到長春西汀能降低p-STAT3/p-Akt的表達。
　　小結(jié)：
　　1)長春西汀抑制乳腺癌瘤體增長并誘導(dǎo)乳腺癌組織的凋亡。
　　2)長春西汀能降低瘤體組織