沙蟾毒精誘導乳腺癌細胞凋亡的作用機制研究.pdf

1、目的：揭示沙蟾毒精誘導乳腺癌細胞凋亡的作用機制，為沙蟾毒精的臨床應用和新藥開發(fā)提供實驗基礎，并研究YAP（Yes-associated protein）在沙蟾毒精誘導的乳腺癌細胞凋亡中的角色，為揭示YAP在細胞凋亡中的作用提供研究實例。
　　方法：（1）采用MTT法評價沙蟾毒精對乳腺癌細胞體外增殖抑制作用。（2）構建MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型，評價沙蟾毒精的體內(nèi)抗腫瘤活性。（3）采用免疫組化法檢測 MDA-MB-231裸鼠

2、移植瘤腫瘤組織中細胞增殖活力和凋亡情況。（4）運用TUNEL熒光染色法和Annexin V-PI雙染法檢測沙蟾毒精誘導乳腺癌細胞凋亡作用。（5）采用免疫熒光法和免疫印跡法檢測沙蟾毒精處理前后YAP的表達水平和細胞內(nèi)的分布情況。（6）通過siRNA技術沉默YAP和 Lats1在MCF-7細胞中表達。（7）采用免疫印跡法分析凋亡相關蛋白以及MAPK信號通路相關蛋白的表達和磷酸化水平。（8）運用免疫共沉淀法和免疫印跡法分析檢測堿性磷酸酶處理前

3、后對YAP在凝膠中的遷移運動的影響,以及用SP600125（JNK抑制劑），SB203580(p38抑制劑)，U0126(MEK抑制劑)預處理乳腺癌細胞對沙蟾毒精導致的YAP遷移滯后的影響。（9）運用Annexin V-PI雙染法、免疫印跡法和實時定量PCR分別檢測了SP600125預處理MCF-7細胞對沙蟾毒精誘導的細胞凋亡、凋亡蛋白表達水平和凋亡基因轉錄水平的影響。（10）染色質免疫沉淀分析YAP與凋亡基因的結合。
　　結果：

4、（1）沙蟾毒精在體內(nèi)外都具有良好的抗乳腺癌活性，能抑制乳腺癌移植瘤組織中腫瘤細胞的增殖活力，并能誘導腫瘤細胞凋亡，實驗結果還顯示沙蟾毒精在體外誘導乳腺癌細胞凋亡具有時間和劑量依賴性。（2）共聚焦實驗和免疫印跡法結果顯示，沙蟾毒精能夠促進YAP從胞漿轉移到胞核內(nèi)，同時觀察到YAP電泳條帶出現(xiàn)遷移（3）siRNA YAP預處理能逆轉沙蟾毒精誘導的凋亡（4）經(jīng)堿性磷酸酶處理后，沙蟾毒精引起的YAP遷移滯后現(xiàn)象被抑制，說明YAP遷移滯后是由蛋白

5、磷酸化修飾造成的。進一步觀察發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精可導致YAP促凋亡活性位點Tyr537被磷酸化。（5）使用SP600125（JNK抑制劑），SB203580（p38抑制劑）和U0126（MEK抑制劑）預處理細胞，發(fā)現(xiàn)只有JNK的抑制劑能逆轉沙蟾毒精誘導的YAP遷移滯后和磷酸化現(xiàn)象，說明JNK參與YAP磷酸化的調(diào)控；（6）結合免疫共沉淀和染色質共沉淀實驗結果，我們發(fā)現(xiàn)YAP入核后與p73的結合能力顯著增強，同時YAP與凋亡基因Bax的啟動子結合增