沙蟾毒精誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：揭示沙蟾毒精誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為沙蟾毒精的臨床應(yīng)用和新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并研究YAP（Yes-associated protein）在沙蟾毒精誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡中的角色，為揭示YAP在細(xì)胞凋亡中的作用提供研究實(shí)例。
　　方法：（1）采用MTT法評(píng)價(jià)沙蟾毒精對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖抑制作用。（2）構(gòu)建MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型，評(píng)價(jià)沙蟾毒精的體內(nèi)抗腫瘤活性。（3）采用免疫組化法檢測 MDA-MB-231裸鼠

2、移植瘤腫瘤組織中細(xì)胞增殖活力和凋亡情況。（4）運(yùn)用TUNEL熒光染色法和Annexin V-PI雙染法檢測沙蟾毒精誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡作用。（5）采用免疫熒光法和免疫印跡法檢測沙蟾毒精處理前后YAP的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)的分布情況。（6）通過siRNA技術(shù)沉默YAP和 Lats1在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)。（7）采用免疫印跡法分析凋亡相關(guān)蛋白以及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)和磷酸化水平。（8）運(yùn)用免疫共沉淀法和免疫印跡法分析檢測堿性磷酸酶處理前

3、后對(duì)YAP在凝膠中的遷移運(yùn)動(dòng)的影響,以及用SP600125（JNK抑制劑），SB203580(p38抑制劑)，U0126(MEK抑制劑)預(yù)處理乳腺癌細(xì)胞對(duì)沙蟾毒精導(dǎo)致的YAP遷移滯后的影響。（9）運(yùn)用Annexin V-PI雙染法、免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測了SP600125預(yù)處理MCF-7細(xì)胞對(duì)沙蟾毒精誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、凋亡蛋白表達(dá)水平和凋亡基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。（10）染色質(zhì)免疫沉淀分析YAP與凋亡基因的結(jié)合。
　　結(jié)果：

4、（1）沙蟾毒精在體內(nèi)外都具有良好的抗乳腺癌活性，能抑制乳腺癌移植瘤組織中腫瘤細(xì)胞的增殖活力，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示沙蟾毒精在體外誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡具有時(shí)間和劑量依賴性。（2）共聚焦實(shí)驗(yàn)和免疫印跡法結(jié)果顯示，沙蟾毒精能夠促進(jìn)YAP從胞漿轉(zhuǎn)移到胞核內(nèi)，同時(shí)觀察到Y(jié)AP電泳條帶出現(xiàn)遷移（3）siRNA YAP預(yù)處理能逆轉(zhuǎn)沙蟾毒精誘導(dǎo)的凋亡（4）經(jīng)堿性磷酸酶處理后，沙蟾毒精引起的YAP遷移滯后現(xiàn)象被抑制，說明YAP遷移滯后是由蛋白

5、磷酸化修飾造成的。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精可導(dǎo)致YAP促凋亡活性位點(diǎn)Tyr537被磷酸化。（5）使用SP600125（JNK抑制劑），SB203580（p38抑制劑）和U0126（MEK抑制劑）預(yù)處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有JNK的抑制劑能逆轉(zhuǎn)沙蟾毒精誘導(dǎo)的YAP遷移滯后和磷酸化現(xiàn)象，說明JNK參與YAP磷酸化的調(diào)控；（6）結(jié)合免疫共沉淀和染色質(zhì)共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)YAP入核后與p73的結(jié)合能力顯著增強(qiáng)，同時(shí)YAP與凋亡基因Bax的啟動(dòng)子結(jié)合增