甘藍SCR識別結合SRK胞外域核心區(qū)的酵母雙雜交檢測及SCR相應編碼區(qū)DNA序列的確定.pdf

1、結球甘藍(BrassicaoleraceaL.var.capitataL.)是白花菜目、十字花科、蕓薹屬植物,屬于甘藍(BrassicaoleraceaL.)的一個變種,其種植栽培地區(qū)已遍及全國各地,是我國主要的種植蔬菜之一。甘藍屬于雌雄同花植物,為了避免近交衰退等白花傳粉帶來的不利影響,甘藍進化出可以造成雜交優(yōu)勢明顯的自交不親和現(xiàn)象,研究表明包括甘藍在內的蕓薹屬植物的自交不親和性是由具有復等位基因的單一位點——S位點控制。其中自交不親

2、和反應的起始扳機反應是S位點富含半胱氨酸蛋白(S-locuscysteine-richprotein,SCR)與S位點受體激酶(S-receptorkinase,SRK)之間的相互作用,兩者之間相互識別和結合核心區(qū)段的位置及氨基酸殘基組成尚不完全清楚,是目前的研究熱點之一。本研究以結球甘藍D3的花藥cDNA為初始模板,利用巢式RT-PCR、酵母雙雜交技術深入研究了S位點受體激酶與S位點富含半胱氨酸蛋白相互作用,主要研究內容和結果如下:<

3、br>　　 1、SCR基因的克隆及其生物信息學分析
　　 通過SCR信號肽保守氨基酸和mRNA的ployA區(qū)設計引物,利用巢式PCR,以甘藍cDNA為模板,克隆了甘藍D3的SCR基因的部分cDNA序列,長度為319bp,包含一個開放閱讀框、3'-UTR區(qū)和ployA區(qū),編碼58個氨基酸的SCR蛋白。在二級結構預測上,預測結果顯示序列中包含a-螺旋和β-折疊結構。由系統(tǒng)進化樹可知,S3與S20的SCR親緣關系較近,說明這兩個單倍

4、型的SCR在演化過程中分支時間較晚;與S28的SCR親緣關系較遠,說明二者的SCR在進化上較早時間開始分支。
　　 2、不同截短長度的S位點富含半胱氨酸蛋白(SCR)片段的克隆及其序列特征
　　 本研究利用高度自交不親和材料D3,提取其花藥中RNA,獲得DNA模板,然后設計引物,通過PCR技術獲得相應的目的片段。理論分析表明各個片段其大小是292bp、256bp、239bp、66bp、90bp、135bp、141bp、1

5、44bp、60bp、108bp、78bp、54bp、63bp和33bp,可以編碼49、39、31、22、30、45、47、38、20、36、26、18、21和11個氨基酸殘基。
　　 3、母雙雜交重組誘餌質粒的毒性及自激活檢測
　　 Y2Gold[pGBKT7SCRn]和Y2Gold[PGBKT7]轉化株在SD/-Trp平板上生長狀態(tài)良好,并且菌斑大小無明顯差異;此表明誘餌質粒pGBKT7SCRn表達對酵母細胞無毒性作用

6、。另外,Y2Gold[pGBKT7SCRn]在SD/-Trp/x-a-Gal平板上生長、在SD/-Trp/x-a-Gal/AbA平板上不生長,其中在SD/-Trp/x-a-Gal平板上生長的菌落無明顯藍色出現(xiàn),說明pGBKT7SCRn在酵母細胞中沒有激活報告基因,無自激活現(xiàn)象出現(xiàn)。
　　 4、酵母雙雜交法檢測甘藍SCR與SRK之間的相互作用
　　 由酵母雙雜交試驗結果表明同時進行試驗的14個實驗組中,只有pGADT7eS

7、RKD3xpGBKT7SCR4和pGADT7eSRKD3xpGBKT7SCR5在SD/-Trp/Leu/x-a-Gal/AbA平板上長出明顯的藍色菌落,說明激活了報告基因,證明酵母雙雜交系統(tǒng)可以用于SCR與SRK發(fā)生相互作用的識別位點位的證明,試驗結果還表明兩者相互作用識別位點位于SCR的成熟肽序列開始到Cys3之間,這從實驗上首次證明了SCR與SRK的相互識別位點確實在該區(qū)域,即SCR3與其相對應的SRK胞外域有相互作用的DNA片段位

8、于SCR的第97～186bp處。由實驗組pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR4和pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR5在平板上長出明顯的藍色菌落,但信號肽剪切位點及其鄰近的幾個氨基酸殘基缺失的實驗組pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR1和pGADT7eSRKD3×pGBKT7SCR13在平板上無菌落長出的結果說明信號肽剪切位點及其鄰近的幾個氨基酸殘基缺失的實驗組SCR1和SCR13與eSRK無相互作用。推測這可能