甘藍(lán)SRK的S域酵母雙雜交表達(dá)載體的構(gòu)建及其與SCR作用區(qū)段的研究.pdf

1、蕓薹屬植物自交不親和性受單一位點的復(fù)等位基因控制，此位點被命名為S位點。它決定柱頭表面花粉識別的專一性。S受體激酶基因(SRK)和S位點糖蛋白基因(SLG)是控制蕓薹屬植物花柱自交不親和性的兩個關(guān)鍵因子。SRK是自交不親和專一性的決定因子，SLG僅是輔助因子，而S位點富半胱氨酸蛋白(SCR)是SRK激酶的配體分子，并且三基因完全連鎖。蛋白質(zhì)是生命功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，揭示蛋白與蛋白間的相互作用，已成為揭示蛋白質(zhì)組復(fù)雜體系與蛋白質(zhì)功能模式的先導(dǎo)

2、。本實驗采用酵母雙雜交技術(shù)檢測甘藍(lán)SRK胞外域不同片段與SCR不同片段蛋白間相互作用。通過PCR擴(kuò)增甘藍(lán)SRK胞外域不同片段序列及SCR不同片段基因編碼序列，擴(kuò)增的片段分別與質(zhì)粒載體pGADT7和pGBKT7連接，構(gòu)建pGADT7-eSRKs和pGBKT7-SCRs系列重組載體。檢測轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold的釣餌質(zhì)粒是否具有自激活發(fā)生以及重組釣餌蛋白的毒性。將pGBKT7和pGADT7的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2HGold和Y187檢測

3、蛋白間是否具有相互作用，通過SD/-Leu-Trp-His-Ade培養(yǎng)基篩選得到pGBKT7-SCRs和pGADTT-eSRKs的陽性克隆，然后用X-a-Gal顯色反應(yīng)鑒定轉(zhuǎn)化到酵母中的兩個重組質(zhì)粒相互作用。主要研究結(jié)果總結(jié)如下：
　　 1.不同截短長度的S位點受體激酶胞外域(eSRK)片段的克隆及其結(jié)構(gòu)特征以結(jié)球甘藍(lán)B3幼葉的gDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增不同片段長度的eSRKs基因。經(jīng)1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測，eSR

4、Ks的目的片段大小均與引物的理論擴(kuò)增值大小相符。利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建酵母雙雜交pGADT7-eSRKs表達(dá)載體，DNA測序結(jié)果分析表明，pGADT7-eSRKs載體中包含有eSRKs片段且插入的eSRKs片段序列與eSRK28序列完全一致。BLAST在線分析結(jié)果表明，eSRKB3編碼421個氨基酸，包含了SRK蛋白B-Lectin結(jié)構(gòu)域、SLG結(jié)構(gòu)域和PAN-APPLE結(jié)構(gòu)域，是SRK胞外域的全長；eSRK1包含了eSRK序列的三個高變

5、區(qū)域，是編碼第5位至第427位氨基酸；eSRK2包含了eSRK序列的兩個高變區(qū)域，編碼第139位至第427位氨基酸；eSRK3包含了eSRK序列的兩個高變區(qū)域，編碼第5位至第273位氨基酸；eSRK4包含了eSRK序列的一個高變區(qū)域，編碼第5位至第140位氨基酸。
　　 2.酵母雙雜交重組AD質(zhì)粒的毒性及自激活檢測將pGADT7空載和pGADT7-eSRKs轉(zhuǎn)化Y187，觀察得到Y(jié)187[pGADT7]和Y187[pGADT7-

6、eSRKs]在SD/-Leu平板上生長狀態(tài)良好，由此表明重組表達(dá)質(zhì)粒pGADT7-eSRKs成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞Y187且無毒性作用。此外，Y187[pGADT7-eSRKs]在SD/-Leu平板上呈現(xiàn)生長狀態(tài)良好的白色菌斑；在SD/-Leu/x-a-gal平板上沒有明顯藍(lán)色克隆出現(xiàn)。由此可說明pGADT7-eSRKs重組載體在酵母細(xì)胞中沒有激活報告基因MEL1，無自身的轉(zhuǎn)錄激活作用發(fā)生。
　　 3.SCRs與eSRKs片段間相互作

7、用檢測利用生物信息學(xué)分析軟件autodocktools對eSRKs與SCRs進(jìn)行相互作用分析，結(jié)果表明eSRKs與SCRs在空間能夠相互識別形成融合蛋白。
　　 試驗顯示eSRKs與SCRs片段間兩兩組合的9個試驗組均能在DDO平板上出現(xiàn)生長狀態(tài)良好的菌斑，其中有Y187[pGADT7-eSRK1]×Y2HGold[pGBKT7-SCR2和Y187[pGADT7-eSRK4]×Y2HGold[pGBKT7-SCR2]2個試驗組能