基于酵母雙雜交系統(tǒng)ABI5保守區(qū)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的相互作用性研究.pdf

1、擬南芥ABI5家族有9個(gè)成員，對(duì)這些成員進(jìn)行蛋白多序列比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)有7個(gè)保守區(qū)，其中保守區(qū)II（CRII）在酵母細(xì)胞中激活轉(zhuǎn)錄。當(dāng)保守區(qū)I（CRI）、保守區(qū)II（CRII）、保守區(qū)III（CRIII）分別一起存在時(shí)，CRII的轉(zhuǎn)錄激活作用被抑制。據(jù)此，本論文以ABI5家族中最小成員-AtDPBF4的序列為模板，構(gòu)建了編碼AtDPBF4的CRI、CRII、CRIII三個(gè)保守區(qū)的重組質(zhì)粒，以期通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)了解CRI、CRIII與CRII

2、之間是否存在相互作用，深入探討CRI和CRIII抑制CRII活性的機(jī)制。
　　本論文的研究結(jié)果如下：
　　1.對(duì)AtDPBF4基因序列編碼的氨基酸序列的理化性質(zhì)、疏水性、磷酸化位點(diǎn)、保守序列、高級(jí)結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。ProtParam分析結(jié)果顯示該序列的總分子量為29.19 kD，氨基酸數(shù)目為262，理論等電點(diǎn)為8.89。ExPASy中的ProtScale進(jìn)行該蛋白序列的疏水性分析，結(jié)果顯示序列中第145位

3、谷氨酰胺疏水性最弱，疏水指數(shù)為-2.978，第117位丙氨酸疏水性最強(qiáng)，疏水指數(shù)為1.778。NetPhos2.0磷酸化位點(diǎn)分析表明該序列可能含有11個(gè)磷酸化位點(diǎn)。SSPro4.0二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白由14個(gè)α-螺旋、6個(gè)β-折疊、1個(gè)β-轉(zhuǎn)角和10個(gè)無(wú)規(guī)卷曲組成。SMART軟件結(jié)構(gòu)域分析顯示在188-260氨基酸之間是一個(gè)堿性亮氨酸拉鏈（basic region leucinzipper,BRLZ）結(jié)構(gòu)域。NCBI CDD分析顯示該

4、序列在192-237之間是一個(gè)bZIP保守結(jié)構(gòu)域。MEGA6.05對(duì)AtDPBF4在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性大于95％的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，顯示該基因?qū)儆贏BI5家族。
　　2.依照AtDPBF4的氨基酸序列化學(xué)合成了CRI、CRII和CRIII片段，分別克隆至pGBKT7和pGADT7中。限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對(duì)質(zhì)粒載體pGBKT7、pGADT7和三個(gè)保守區(qū)片段進(jìn)行限制性雙酶切。CRI和CRIII片段分別克隆進(jìn)p

5、GBKT7質(zhì)粒。由于CRII具有轉(zhuǎn)錄激活活性，因此，CRII被克隆進(jìn)pGADT7載體。重組克隆經(jīng)核苷酸序列分析核實(shí)，最終獲得重組載體pGBKT7-CRI-1、pGBKT7-CRIII-3和pGADT7-CRII-4。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)選用酵母菌Y187作為實(shí)驗(yàn)菌株，將三個(gè)重組質(zhì)粒分成兩個(gè)組合（組合1：pGBKT7-CRI-1+pGADT7-CRII-4；組合2：pGBKT7-CRIII-3+pGADT7-CRII-4）分別進(jìn)行酵母感受態(tài)細(xì)胞