HPV18E6酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構建與檢測.pdf

1、目的：利用酵母雙雜交系統(tǒng)，構建人HPV18E6蛋白酵母雙雜交體系中的誘餌質(zhì)粒，對其進行鑒定，并檢測該誘餌質(zhì)粒在AH109酵母中的表達，以及酵母細胞有無毒性作用和自激活作用。為應用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與HPV18 E6的相互作用蛋白奠定實驗基礎。
　　 方法：培養(yǎng)宮頸腺癌細胞株Hela，常規(guī)提取細胞總RNA后進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用PCR擴增HPV18 E6基因cDNA中編碼完整開放閱讀框的基因片段，純化后用 EcoRI、BamH

2、Ⅰ雙酶切HPV18 E6和酵母表達載體pGBKT7，回收產(chǎn)物并連接，重組質(zhì)粒命名為pGBKT7-HPV18E6，用酶切驗證重組質(zhì)粒的正確性并通過測序檢查質(zhì)粒重組后序列有無變化。用醋酸鋰法(Li-Ac)將序列正確的重組質(zhì)粒pGBKT7-HPV18 E6轉(zhuǎn)入AH109 酵母菌株，在缺陷性培養(yǎng)基上觀察pGBKT7-HPV18 E6在酵母菌AH109中的表達，檢測誘餌質(zhì)粒有無毒性作用和單倍體及二倍體自激活功能。
　　 結果：擴增DNA片

3、段約為650bp，大小正確，擴增后的HPV18 E6基因片段與pGBKT7載體定向重組，克隆重組質(zhì)粒pGBKT7-HPV18E6酶切后顯示的酶切圖譜與預期相同，測序結果表明序列正確，融合區(qū)域的讀碼框正確。誘餌載體pGBKT7-HPV18 E6轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細胞AHl09中，轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒和pGBKT7空載體的酵母菌都能在SD/-Trp/X-α-gal 平板上長出白色菌落，在SD/-His/-Trp/X-α-gal，SD/-Ade/-T

4、rp/X-α-gal平板上不能生長，兩種酵母菌在SD/Trp 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后，菌液的OD600值分別為0.98和0.99，說明AH109[pGBKT7-HPV18E6]轉(zhuǎn)化成功，對酵母菌株AH109 無毒性且不具有自主激活報告基因的功能。
　　 結論：成功構建了在酵母細胞中表達正確，并對酵母細胞無毒性作用且無自主激活報告基因功能的誘餌表達載體pGBKT7-HPV18E6，該載體可作為酵母雙雜交系統(tǒng)中的“誘餌”，該誘餌