苔類植物黃酮類化合物生物合成關(guān)鍵酶功能鑒定.pdf

1、苔蘚植物是一類以孢子繁殖，由水生向陸生、低等向高等過渡的重要植物類群，其分布非常廣泛。因大多數(shù)苔蘚植物的生長環(huán)境都相對比較惡劣，從而使得其體內(nèi)產(chǎn)生了極為豐富的次級代謝產(chǎn)物，這些次級代謝產(chǎn)物具有各種各樣的生物活性，可以作為新藥開發(fā)的先導(dǎo)化合物，因此被稱為是生物活性物質(zhì)的源泉。萜類，聯(lián)芐類和黃酮類化合物是苔蘚植物中的主要次生代謝產(chǎn)物。
　　黃酮類化合物廣泛存在于植物中，是一類低分子量的多酚類化學(xué)物質(zhì)。在一些藥用植物中，黃酮類化合物是主

2、要的藥用成分，而且在很多水果、蔬菜和飲料中也存在各種各樣的黃酮類化合物。植物體內(nèi)存在的黃酮類化合物能夠?qū)χ参锏纳L發(fā)育起到調(diào)節(jié)控制作用，還能夠抵抗外界的非生物脅迫以及昆蟲侵襲等。另外黃酮類化合物還具有抗炎、抗菌、抗過敏、抗氧化以及抗癌等生物活性。其生物合成途徑在高等植物中已經(jīng)得到廣泛而深入的研究，證明黃酮類化合物來自于苯丙烷和丙二酸生物合成途徑。然而由于缺少基因組信息，苔類植物黃酮類化合物生物合成途徑研究較少。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了鈍鱗紫背

3、苔的cDNA文庫，并進(jìn)行了EST測序，也對粗裂地錢進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，本文分別從兩種苔的數(shù)據(jù)庫中尋找到兩個與查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI)具有較高同源性的基因，分別命名為PaCHI1，PaCHI2，MpaCHII和MpaCHI2。將它們構(gòu)建入原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)純化蛋白，進(jìn)行體外酶活功能鑒定，同時對以柚皮素查爾酮為底物的酶活產(chǎn)物進(jìn)行手性分析來鑒定查爾酮異構(gòu)酶的立體選擇性。酶活結(jié)果顯示PaCHI1和MpaCHI1

4、能夠催化柚皮素查爾酮和異甘草素轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的產(chǎn)物柚皮素和甘草素，這是第一次從非豆科植物中發(fā)現(xiàn)typeⅡ查爾酮異構(gòu)酶，而PaCHI2及MpaCHI2沒有催化活性。進(jìn)化樹分析顯示PaCHI2和MpaCHI2與typeⅣ查爾酮異構(gòu)酶(CHI-like)歸為一簇，而PaCHI1和MpaCHI1與typeⅠ，typeⅡ查爾酮異構(gòu)酶歸為一類，但從進(jìn)化關(guān)系上看，PaCHI1和MpaCHI1與typeⅡ查爾酮異構(gòu)酶更為接近。酶活產(chǎn)物手性分析顯示PaCHI

5、1和MpaCHI1具有立體選擇性，能夠選擇性生成2S構(gòu)型的黃酮。
　　黃酮合酶在類黃酮的生物合成途徑中也是至關(guān)重要的酶。本文從鈍鱗紫背苔的cDNA文庫中篩選得到一個與黃酮合酶Ⅰ同源性較高的基因，命名為PaFNSⅠ，通過5'-RACE獲得該基因的全長，并構(gòu)建原核表達(dá)載體，對獲得的重組蛋白進(jìn)行體外酶活功能鑒定。以柚皮素為底物的酶活結(jié)果顯示:該蛋白能夠催化柚皮素生成2-羥基柚皮素和芹菜素，說明該蛋白同時具有F2H(flavanone2-

6、hydroxylase)和FNS(flavone synthase)的功能。以二氫山萘酚為底物的酶活分析結(jié)果顯示該蛋白具有微弱的黃酮醇合酶(FLS)功能;而對圣草酚、二氫槲皮素沒有表現(xiàn)出任何催化活性。通過氨基酸序列比對以及蛋白結(jié)構(gòu)同源模擬，我們最終確定4個關(guān)鍵氨基酸Ala120，Phe146，Tyr240和Leu311，將它們分別突變成:Met120，I1e146，Pro240和Phe311，突變體酶活結(jié)果顯示將Y240突變成P240后

7、，酶活產(chǎn)物只有芹菜素，沒有2-羥基柚皮素的生成，推測是因?yàn)門yr240的苯環(huán)與柚皮素的A環(huán)形成一個疏水的π-π堆積作用，該作用如果被破壞則阻礙了2-羥基柚皮素的生成;又將Y240突變成Ala，Val，Ile和Phe，另外將Ala120，Phe146，Tyr240和Leu311四個突變位點(diǎn)進(jìn)行組合突變，最終綜合分析所有突變體的酶活，結(jié)果確定Y240是2-羥基柚皮素形成的關(guān)鍵氨基酸。本文是第一次報道黃酮合酶Ⅰ(FNSⅠ)具有黃酮2位羥化的活