野葛異黃酮類化合物生物合成新途徑酶學(xué)證據(jù)的初步研究.pdf

1、闡明植物的次級(生)代謝過程,是利用植物次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行醫(yī)藥工程及天然產(chǎn)物開發(fā)研究的前提和基礎(chǔ)。與初級代謝相比,次級代謝是一個公認(rèn)研究難度大,但又是潛力極大的研究領(lǐng)域。而在植物次生代謝的研究中,生物合成途徑的研究屬于機(jī)理研究范疇,是次級代謝研究的核心問題。因此,進(jìn)行植物黃酮類化合物生物合成途徑的研究,不僅可以揭示不同化學(xué)成分在植物體中的形成、轉(zhuǎn)化及其相互關(guān)系的本質(zhì)規(guī)律：而且對進(jìn)一步利用現(xiàn)代生物技術(shù)方法進(jìn)行黃酮化合物的生產(chǎn)也有著實(shí)際的意義

2、。 野葛[Pueraria lobata(Willd)Ohwi.]分類學(xué)上屬于豆科植物,是原產(chǎn)于我國的一種重要的野生植物資源,其主要生物活性成分為葛根素、大豆甙和大豆甙元等異黃酮化合物,含量(干重)高達(dá)7-8％以上,是大豆異黃酮含量(0.1-0.2％干重)的幾十倍。野葛中異黃酮含量高的特點(diǎn),易于次級代謝研究中產(chǎn)物的分離和檢測；野葛懸浮細(xì)胞和野葛愈傷組織的成功培養(yǎng),為開展的次級代謝研究建立了適宜的研究體系并提供了良好的研究基礎(chǔ),是

3、進(jìn)行植物黃酮類化合物生物合成途徑研究的良好試材。 本論文實(shí)驗(yàn)以野葛培養(yǎng)細(xì)胞和野葛愈傷組織為研究體系,通過對預(yù)苯酸脫氫酶和對羥基苯丙酮酸還原酶活性與野葛離體培養(yǎng)體系中異黃酮化合物的生物合成的相關(guān)性研究,以及通過苯丙氨酸解氨酶(PAL)和對香豆酸連接酶(4CL)的專一性抑制劑處理實(shí)驗(yàn),研究野葛離體培養(yǎng)體系中異黃酮化合物的生物合成以及異黃酮生物合成中可能的前體化合物預(yù)苯酸、對羥基苯丙酮酸和對羥基苯丙乳酸的積累情況,為以預(yù)苯酸為前體化合

4、物,經(jīng)對羥基苯丙酮酸、對羥基苯丙乳酸和香豆酸的中間代謝過程的一條異黃酮化合物生物合成新途徑的證實(shí)提供酶學(xué)證據(jù)。實(shí)驗(yàn)取得以下主要結(jié)果： 在野葛細(xì)胞培養(yǎng)周期中,隨著預(yù)苯酸脫氫酶和對羥基苯丙酮酸還原酶活性的提高,細(xì)胞培養(yǎng)體系中異黃酮的積累逐步增加,但異黃酮積累滯后于酶活的提高。通過對預(yù)苯酸脫氫酶和對羥基苯丙酮酸還原酶活性變化與野葛異黃酮化合物生物合成的相關(guān)性分析,結(jié)果表明兩者具有較高的相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)分別為0.8812和0.8046。

5、 以野葛愈傷組織為試驗(yàn)材料,分別對PAL酶活性測定條件以及TTC法測定細(xì)胞活力條件進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,PAL的最適底物濃度為2 mM,最適pH值為8.8,最適反應(yīng)溫度為60℃,酶促反應(yīng)產(chǎn)物可在2.5h內(nèi)保持穩(wěn)定。細(xì)胞活力測定的最適:TTC濃度為0.6％(w/v),最適pH值為7.5,TTC溶液處理的適宜時間范圍為12～16h。 通過不同濃度的PAL專一性抑制劑(AOA)和4CL專一性抑制劑(MDCA)的處理實(shí)驗(yàn),研究野

6、葛愈傷組織的鮮重、干重、酶活、細(xì)胞活力和異黃酮含量的變化情況,得出AOA處理的適宜濃度為10μM,MDCA處理的適宜濃度為25μM。選取10μM為AOA處理的適宜濃度,設(shè)計了三種不同的AOA處理,即①培養(yǎng)0天的野葛愈傷組織、②培養(yǎng)24天(無AOA處理)以及③培養(yǎng)24天(10μM AOA處理),分別收集樣品,進(jìn)行異黃酮含量的分析測定,結(jié)果顯示,處理③較處理①異黃酮含量高出6.141 mg·g-1,且有顯著差異；而處理②較處理③高出18.1

7、97 mg·g-1,兩者間具有極顯著差異；研究表明野葛愈傷組織中可能存在其他異黃酮合成途徑。同時,異黃酮含量(處理③-處理①)與異黃酮含量(處理②-處理③)的差異,則反映了兩條不同途徑在野葛異黃酮生物合成中的貢獻(xiàn)大小,即通過苯丙氨酸-肉桂酸-香豆酸-香豆酰輔酶A-查耳酮的異黃酮生物合成途徑為野葛愈傷黃酮生物合成的主要途徑,而本項(xiàng)目研究的可能存在的異黃酮生物合成途徑為野葛愈傷黃酮合成的輔助途徑。其外,10 μMAOA處理?xiàng)l件下,野葛愈傷組

8、織的預(yù)苯酸、對羥基苯丙酮酸和對羥基苯丙乳酸的含量都較對照的含量高,且差異極顯著：表明AOA處理抑制了PAL酶活性以及異黃酮的生成,但具體機(jī)理不詳。 培養(yǎng)第24天(25μM MDCA處理)野葛愈傷組織樣品的異黃酮含量較培養(yǎng)0天的野葛愈傷組織樣品中異黃酮含量高出2.217 mg·g-1,但兩者差異不顯著。同時,培養(yǎng)第24天的野葛愈傷組織(無MDCA處理)樣品較培養(yǎng)第24天的野葛愈傷組織(25μM MDCA處理)樣品高出22.251

9、mg·g-1,且兩者具有極顯著差異。表明4CL酶是異黃酮合成的關(guān)鍵酶,專一性抑制劑MDCA處理嚴(yán)重阻斷了野葛愈傷體內(nèi)異黃酮的生物合成。其外,25μM MDCA處理?xiàng)l件下,野葛愈傷組織的預(yù)苯酸含量都較對照的含量高,但差異不顯著；而對羥基苯丙酮酸和對羥基苯丙乳酸含量都較對照的含量高,且差異極顯著。同樣表明MDCA阻斷了香豆酸一香豆酰輔酶A的反應(yīng),進(jìn)而阻斷了黃酮化合物生物合成的途徑,降低了異黃酮化合物的積累；并進(jìn)一步通過反饋抑制作用,使得預(yù)苯