MAPK信號(hào)通路對(duì)大鼠低氧性PASMCs中容量激活性氯離子通道表達(dá)及細(xì)胞增值、凋亡的調(diào)控.pdf

1、目的:
　　1.研究低氧性大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)中容量激活性氯離子通道(CLC3)-mRNA和蛋白表達(dá)的變化;
　　2.觀(guān)察低氧性大鼠PASMCs增殖和凋亡的變化;
　　3.探討低氧狀況下大鼠PASMCs中CLC3與MAPK通路之間的關(guān)系。
　　方法:
　　1.解剖SD雄性大鼠，顯微鏡下取出肺動(dòng)脈平滑肌，用組織酶消化法獲取PASMCs，進(jìn)行原代培養(yǎng)。
　　2.采用普通光學(xué)顯微鏡和免疫熒光

2、染色法，分別鑒定PASMCs。
　　3.低氧造模:選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4～6代PASMCs，加入無(wú)血清培養(yǎng)基將其饑餓24 h，后隨機(jī)分為7組(n=6):常氧對(duì)照組(N)、低氧組(H)、DMSO組(D)、ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑U0126組(U)、P38MAPK通路抑制劑SB203580組(S)、茴香霉素Anisomycin即P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活劑組(A)、StaurosporineAglycone即ERK信

3、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活劑組(SA)。N組加入10％培養(yǎng)基后置于常氧培養(yǎng)箱中，其它各組分別加入含相應(yīng)藥物的10％培養(yǎng)基后置于低氧培養(yǎng)箱(3％O2，5％CO2，37℃)中，造模時(shí)間均為48h。
　　4.造模結(jié)束后，分別提取各組細(xì)胞總蛋白，用Western-Blot方法測(cè)定各組PASMCs中CLC3蛋白的表達(dá)。
　　5.造模結(jié)束后，分別提取各組細(xì)胞mRNA，用RT-PCR方法測(cè)定各組PASMCs中CLC3 mRNA的表達(dá)。
　　6.

4、造模完成后，分別在每個(gè)組中加入CCK-8，在450nm處測(cè)量各組OD值，時(shí)間點(diǎn)分別是30min、1h、2h、4h，借此觀(guān)察各組PASMCs的增殖情況。
　　7.PASMCs爬片造模結(jié)束以后，采用TUNEL法測(cè)定各組中PASMCs的凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1.CLC3 mRNA表達(dá)的變化:
　?、俸统Ｑ踅M(N)比，低氧組(H) PASMCs中CLC3 mRNA表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);

5、　　②與低氧組(H)比較，CLC3mRNA在DMSO組(D) PASMCs中表達(dá)變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在U0126組(U)和Anisomycin組(A)兩組PASMCs中表達(dá)都降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05和P＜0.01);SB203580組(S)與Staurosporine Aglycone組(SA)PASMCs中CLC3 mRNA表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.CLC3蛋白表達(dá)的變化

6、:
　?、倥c常氧組(N)相比，CLC3蛋白在低氧組(H) PASMCs中的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　②與低氧組(H)比較，CLC3蛋白在DMSO組(D) PASMCs中表達(dá)變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);在U0126組(U)和Anisomycin組(A)兩組PASMCs中表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05和P＜0.01);SB203580組(S)與Staurosporine Aglycon

7、e組(SA)PASMCs中CLC3蛋白表達(dá)均上調(diào)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05和P＜0.01)。
　　3.各組PASMCs增殖情況:
　?、倥c常氧組(N)相比，低氧組(H) PASMCs的OD值顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);
　?、谂c低氧組(H)相比，DMSO組(D) PASMCs的OD值無(wú)顯著變化(P＞0.05);U0126組(U)與茴香霉素Anisomycin組(A)兩組PASMCs的OD值均下降，

8、差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);SB203580組(S)與Staurosporine Aglycone組(SA) PASMCs OD值均上調(diào)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.各組PASMCs凋亡情況:
　?、倥c常氧組(N)比，低氧組(H) PASMCs凋亡指數(shù)變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　?、谂c低氧組(H)相比，DMSO組(D) PASMCs凋亡指數(shù)無(wú)明顯變化(P＞0.05);U0126

9、組(U)與茴香霉素Anisomycin組(A)兩組 PASMCs的凋亡指數(shù)均升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);SB203580組(S)與Staurosporine Aglycone組(SA) PASMCs凋亡指數(shù)均下調(diào)，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.在低氧條件下PASMCs中CLC3的表達(dá)升高，PASMCs活性增強(qiáng)，但其凋亡情況卻并無(wú)明顯的改變;
　　2.U0126-即ERK1

10、/2的通路抑制劑可以使能低氧性PASMCs中CLC3的表達(dá)降低，Staurosporine Aglycone-即ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活劑可以使PASMCs中CLC3的表達(dá)水平升高。提示低氧可通過(guò)激活PASMCs中的ERK1/2使CLC3的表達(dá)增加;
　　3.SB203580-即P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑可以使CLC3在PASMCs中的表達(dá)升高，茴香霉素Anisomycin-即P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活劑可以使

11、CLC3在PASMCs中的表達(dá)水平降低，說(shuō)明低氧會(huì)通過(guò)激活PASMCs中的P38MAPK使CLC3的表達(dá)下降;
　　4.U0126-即ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑可使低氧性PASMCs活性下降、凋亡增多，Staurosporine Aglycone-即ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活劑可使低氧性PASMCs活性增加、凋亡減少，表明低氧對(duì)PASMCs增殖和凋亡的調(diào)控可通過(guò)激活ERK1/2來(lái)實(shí)現(xiàn);
　　5.SB203580-即