新生大鼠卵母細(xì)胞凋亡信號通路調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究FOXO3a（forkhead box group O）轉(zhuǎn)錄因子是否參與調(diào)控哺乳動物卵巢中裸露卵母細(xì)胞和原始卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞的凋亡及其調(diào)控通路。
　　 方法：（1）體外分離培養(yǎng)新生兩天大鼠卵母細(xì)胞巢和原始卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞。（2）實(shí)驗(yàn)分組和藥物處理細(xì)胞方法：干細(xì)胞因子（Stem cell factor， SCF）和磷脂酰肌醇- 3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抑制劑LY 294002作

2、用細(xì)胞的終濃度分別為150ng/L和25μM。實(shí)驗(yàn)分為三組：未經(jīng)處理的細(xì)胞作為對照組（SCF-），SCF處理細(xì)胞組（SCF+）和SCF聯(lián)合LY 294002處理細(xì)胞組（SCF+LY 294002）。為研究SCF對AKT、FOXO3a磷酸化的影響及其調(diào)控通路，SCF處理細(xì)胞組：SCF作用于細(xì)胞5 min；SCF聯(lián)合LY 294002處理細(xì)胞組：LY 294002作用于細(xì)胞1 h后再加入SCF作用5 min。為研究SCF對卵母細(xì)胞凋亡和Bi

3、m、Bcl-2、Bax、Bad、MnSOD和p27kip1表達(dá)的影響及其調(diào)控通路，SCF處理細(xì)胞組：SCF作用于細(xì)胞24 h；SCF聯(lián)合LY 294002處理細(xì)胞組：SCF與LY 294002同時加入細(xì)胞培養(yǎng)基，共同作用24 h。（3）凋亡染色（TUNEL）觀察卵母細(xì)胞凋亡狀況。陽性結(jié)果判斷: 被染成棕黃色的為陽性細(xì)胞。凋亡率的計算方法:在400倍視野下，每張玻片上選取至少三個視野共100個細(xì)胞計數(shù)陽性卵母細(xì)胞占所有卵母細(xì)胞的百分比。（

4、4）RT-PCR、Western blot檢測觀察FOXO3a及其下游靶分子與卵母細(xì)胞凋亡的關(guān)系。（5）免疫細(xì)胞化學(xué)檢測：細(xì)胞分別與一抗FOXO3a、BIM、BAD、BAX、BCL-2、MnSOD或p27KIP1 (抗體1:25 或1:100稀釋) 及對應(yīng)的二抗孵育；3,3'二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine，DAB) 顯色。細(xì)胞陽性率的計算方法: 在400倍視野下，每張玻片上選取至少三個視野共100個細(xì)胞計數(shù)，得

5、出陽性卵母細(xì)胞占所有卵母細(xì)胞的百分比。（6）采用SPSS 13. 0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x±s) 表示,組間比較均作單向方差分析, P ＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。
　　 結(jié)果：（1）SCF抑制卵母細(xì)胞凋亡；而LY 294002可完全阻斷上述效果。（2）SCF不影響卵母細(xì)胞AKT、FOXO3a總蛋白表達(dá)水平，但可使其磷酸化水平增加；磷酸化的AKT活性增強(qiáng)，而磷酸化的FOXO3a 活性下

6、降。（3）SCF可使Bim、Bax、Bad和p27kip1表達(dá)下調(diào)，此作用同樣可被LY 294002逆轉(zhuǎn)。（4）SCF可使MnSOD表達(dá)上調(diào)，LY 294002可阻斷該效果。（5）SCF不影響B(tài)cl-2的表達(dá)。
　　 結(jié)論：（1）FOXO3a通過SCF-PI3K/AKT信號通路參與對新生大鼠卵母細(xì)凋亡和原始卵泡形成的調(diào)控。（2）Bim、Bax、Bad、MnSOD和p27kip1可能作為FOXO3a的下游靶分子參與以上調(diào)控過程。<