AT1-Calcineurin信號通路在乳鼠肥大心室肌細胞離子通道表達調(diào)控中的作用.pdf

1、背景和目的：心肌肥大(CH)是心臟對各種原因引起的工作負荷增加做出的一種代償性反應(yīng)，但長期存在最終因心室重構(gòu)失代償而發(fā)展為充血性心力衰竭。研究證實，肥大刺激下心臟內(nèi)部局部腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)被激活，細胞內(nèi)血管緊張素受體1型(AT1)活化，參與了促心肌肥大過程。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（CaN）是 AT1下游的信號分子之一，在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。心肌肥大、心衰患者其室性心律失常風(fēng)險顯著增加，其原因之一是在心肌細胞肥大時存

2、在心室肌電重構(gòu)，而離子通道重構(gòu)是電重構(gòu)的基礎(chǔ)。由此推測AT1-CaN信號通路可能參與了肥大心室肌細胞的離子通道重構(gòu)的調(diào)控。本研究通過培養(yǎng)原代乳鼠心室肌細胞，苯腎上腺素( PE)刺激促心室肌細胞肥大，分別予AT1拮抗劑氯沙坦（Los）、CaN抑制劑環(huán)孢素（CsA）和重組腺病毒shRNA干擾載體介導(dǎo)沉默編碼CaN之A亞基β亞型（CnAβ）的基因(Ad-CnAβshRNA)等干預(yù)，研究AT1-CaN信號通路對肥大心室肌細胞離子通道表達的影響。

3、
　　方法:1天齡SD大鼠乳鼠，消化分離心室肌細胞，培養(yǎng)48 h后藥物干預(yù)分組：①對照組：不予干預(yù)，共培養(yǎng)26h。② PE組：給予PE100μM，培養(yǎng)24 h。③ Los+PE組：給予氯沙坦10μM預(yù)處理2h，繼之加入PE100μM培養(yǎng)24 h。④CsA+PE組：給予環(huán)孢素10μg/ml預(yù)處理2h，繼之加入PE100μM干預(yù)24 h。重組腺病毒shRNA介導(dǎo)RNA干擾實驗分組：取MOI=50對應(yīng)的重組腺病毒，① Ad-Null：加

4、入腺病毒空載體，感染48h。②Ad- Null+PE組：加入腺病毒空載體，感染24h后加PE100μM，繼續(xù)培養(yǎng)24h。③ Ad-CnAβShRNA1組：加入Ad-CnAβShRNA1，感染48h。④ Ad-CnAβShRNA1+PE組：加入 Ad-CnAβShRNA1，感染24h后加PE10μM，繼續(xù)培養(yǎng)24h。適時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測BNP、ANP、β-MHC、Nav1.5和Kv4.2 mRNA表達。免疫印跡法檢測全細胞提取蛋白

5、CnAβ、Nav1.5、Kv4.2表達。
　　結(jié)果：PE干預(yù)24 h明顯增加心室肌細胞蛋白/DNA比值，增加細胞ANP、BNP、β-MHC mRNA表達，增大細胞面積；上調(diào)CnAβ蛋白表達，下調(diào)Nav1.5蛋白表達，下調(diào)Kv4.2蛋白及mRNA表達；Nav1.5 mRNA表達與其蛋白表達趨勢一致，但無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。CsA和Los干預(yù)明顯抑制PE干預(yù)的上述效應(yīng)。PE干預(yù)感染Ad-Null的心室肌細胞明顯上調(diào)BNP mRNA表達，下