氯離子通道在卵巢癌細胞中的表達及其在細胞增殖中的作用.pdf

1、卵巢癌是女性生殖器官常見的三大惡性腫瘤之一，惡性度高，早期診斷困難，多數(shù)患者就診時已屬晚期，死亡率居婦科惡性腫瘤首位。卵巢癌細胞具有高的增殖及轉(zhuǎn)移潛力，然而對其惡性生物學(xué)行為機制尚不明確。因此研究卵巢癌的惡性生物學(xué)行為機制，尋找新的治療靶點，成為亟待解決的任務(wù)。 氯離子通道廣泛分布于有機體的細胞膜及細胞器膜，其在細胞的容積調(diào)節(jié)、物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運、細胞電位、細胞器的酸化、細胞增殖分化等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。氯離子通道在體內(nèi)的調(diào)

2、控受多種因素的的影響，根據(jù)功能及門控機制，氯通道可分為：電壓門控性氯離子通道（Voltage-gated chloride channels，CLC）、容積調(diào)控性氯離子通道（Volume-regulated/sensitive anion/chloride channels，VRAC）、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)體（Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator， CFTR）、鈣激活性

3、氯離子通道（Calcium-activated chloride channels，CLCA）、配體激活的氯離子通道（ligand-activated chloride channels）。配體激活的氯通道主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)。氯離子通道參與多種細胞的增殖，氯通道阻滯劑對諸如肝細胞、肺主動脈內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞等多種細胞的增殖具有抑制作用。引人矚目的是：近年多項研究發(fā)現(xiàn)氯離子通道在多種腫瘤中表達異常，并且氯通道可能在腫瘤細胞

4、的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為中起著重要作用。例如：CLC氯通道在腦膠質(zhì)瘤組織和細胞中過表達，這有利于細胞大小和形狀的改變，從而導(dǎo)致瘤細胞易于分裂和侵襲狹窄的細胞外腦間隙；容積調(diào)控性氯離子通道是調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞通過G1期限制點，促進細胞增殖的重要因子；還有研究報道其在腫瘤細胞中呈細胞周期依賴性改變。CLC-3是CLC氯離子通道的重要家族成員，并且CLC-3又是容積調(diào)控性氯離子通道最有可能的候選蛋白，所以其功能復(fù)雜多樣，有研究報道前列腺

5、癌細胞中抗凋亡調(diào)節(jié)因子呈劑量依賴性上調(diào)CLC-3蛋白表達水平，使細胞生存能力提高而抗凋亡。另有研究發(fā)現(xiàn)抑制CLC-3蛋白表達后，腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力降低。 迄今為止，國內(nèi)外尚未見氯離子通道在卵巢上皮性癌細胞中的表達情況及其對卵巢上皮性癌細胞增殖及細胞周期的影響。因此我們研究的目的是觀察氯通道在卵巢上皮性癌細胞中的表達、探索氯離子通道在卵巢上皮性癌細胞增殖及細胞周期中的作用以及CLC-3單通道改變對卵巢癌細胞增殖的影響。

6、 目的：觀察氯離子通道在卵巢上皮性癌細胞株A2780中的表達，探討氯離子通道在卵巢癌細胞株A2780增殖及細胞周期中的作用。 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測幾種有代表性的氯離子通道m(xù)RNA在卵巢上皮性癌細胞中的基因表達；應(yīng)用免疫細胞化學(xué)方法檢測氯離子通道蛋白在A2780細胞中的表達。采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法，觀察不同濃度及種類的氯離子通道阻滯劑阻斷卵巢癌細胞氯離子通道后，卵巢癌細胞株A2780增殖活力的變

7、化；采用流式細胞儀技術(shù)檢測不同濃度及種類的氯離子通道阻滯劑阻斷卵巢癌細胞氯離子通道后，卵巢癌細胞A2780細胞周期的變化。 結(jié)果：RT-PCR檢測提示卵巢癌細胞株A2780表達CLC-3及CFTR氯離子通道m(xù)RNA；但未檢測到hCLCA-2 mRNA表達。免疫細胞化學(xué)染色顯示卵巢癌細胞A2780表達CLC-3及CFTR氯離子通道蛋白，蛋白表達定位于細胞質(zhì)膜。MTT檢測表明不同濃度的氯通道阻滯劑NPPB、NFA、TAM作用細胞后明

8、顯抑制了A2780細胞的增殖活力。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的NPPB對A2780細胞的抑制率分別為23．4％、59．2％、90．8％及93．5％，各濃度組與對照組相比差異均有顯著性（P<0．05）。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的NFA對A2780細胞的抑制率分別為18．3％、40．9％、68．6％及75．1％，各濃度組與對照組相比差異均有顯著

9、性（P<0．05）。10μmol/L、20μmol/L及30μmol/L的TAM對A2780細胞的抑制率分別為65．8％、73．4％及77．5％，各濃度組與對照組相比差異均有顯著性（P<0．05）。而相對特異性CFTR氯通道阻滯劑Glibenclamide作用細胞后對A2780細胞的增殖活力無明顯影響。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L的Glibenclamide對A2780細胞增殖的抑制率分別為

10、2．1％、2．8％、3．7％及3．9％，各濃度組與對照組相比，差異無顯著性（P>0．05）。 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)不同濃度的氯離子通道阻滯劑NPPB、NFA、TAM作用A2780細胞72 h后，細胞周期的G0/G1和S期細胞分布均發(fā)生改變，細胞周期停滯于G0/G1期。而Glibenclamide作用A2780細胞后，細胞周期的G0/G1和S期細胞分布改變無統(tǒng)計學(xué)差異。 1 NPPB對A2780細胞周期的影響50μmol/l

11、、100μmol/L及200μmol/L的NPPB作用于A2780細胞后：細胞周期的G0/G1期細胞數(shù)由55．4±2．1％分別增加到73．1±3．9％、84．2±2．3％及86．5±2．6％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。S期細胞數(shù)由34．0±2．5％分別下降至22．3±4．1％、12．1±2．3％及10．7±1．6％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。 2 NFA對A2780細胞周期

12、的影響50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L的NFA作用于A2780細胞后：細胞周期的G0/G1期細胞數(shù)由55．4±2．1％分別增加到69．3±3．5％、74．6±2．1％及79．5±3．6％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。S期細胞數(shù)由34．0±2．5％分別下降至24．1±1．5％、18．7±1．9％及13．4±2．7％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。 3 TAM

13、對A2780細胞周期的影響10μmol/L、20μmol/L及30μmol/L的TAM作用于A2780細胞后：細胞周期的G0/G1期細胞數(shù)由55．4±2．1％分別增加到68．7±2．4％、73．8±3．3％及79．4±3．1％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。S期細胞數(shù)由34．0±2．5％分別下降至24．6±1．9％、20．3±2．2％及15．3±1．6％，各濃度組與對照組相比，差異均有顯著性（P<0．05）。

14、 4 Glibenclamide對A2780細胞周期的影響50μmol/L、100μmol/L及200μmol/L的Glibenclamide作用于A2780細胞后：細胞周期的G0/G1期細胞數(shù)由55．4±2．1％分別改變?yōu)?5．8±2．9％、53．1±3．2％及54．2±3．5％，各濃度組與對照組相比差異均無顯著性（P>0．05）；S期細胞數(shù)由34．0±2．5％分別改變?yōu)?3．7±2．6％、36．9±1．6％及35．6±2．8％，

15、各濃度組與對照組比較差異均無顯著性（P>0．05）。 結(jié)論：CLC及CFTR氯離子通道在卵巢癌細胞系A(chǔ)2780中表達。電壓門控性氯離子通道及容積調(diào)控性氯離子通道可能在卵巢上皮性癌細胞的增殖及細胞周期中起著重要作用。 目的：觀察電壓門控性氯離子通道-3（CLC-3）反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對卵巢上皮性癌細胞A2780增殖及細胞周期的影響。 方法：以脂質(zhì)體Lipofectamine介導(dǎo)的CLC-3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染卵巢上皮性癌

16、細胞株A2780，利用Western blot檢測轉(zhuǎn)染CLC-3反義寡核苷酸后A2780細胞CLC-3蛋白表達的變化；通過MTT法、流式細胞儀檢測細胞增殖能力及細胞周期的變化。應(yīng)用Western blot檢測CLC-3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對卵巢癌細胞A2780細胞周期素D1（CyclinD1）表達的影響。 結(jié)果：卵巢上皮性癌細胞A2780轉(zhuǎn)染CLC-3反義寡核苷酸后，CLC-3的蛋白表達明顯降低。50μg/ml和100μg/ml C