自聚合肽納米纖維材料聯(lián)合RhoA抑制劑CT04促進(jìn)小鼠脊髓損傷修復(fù).pdf

1、本研究旨在為急性脊髓損傷探索一種新的治療策略——自聚合肽納米纖維材料(self-assembling peptide nanofiber scaffold，SAPNS)聯(lián)合RhoA抑制劑(RhoA inhibitor CT04)促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。
　　 目前為止關(guān)于脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)性治療方案有很多，如手術(shù)治療，物理治療，中醫(yī)治療，藥物治療，移植治療等，這些治療方法于一定程度上促進(jìn)了脊髓損傷動(dòng)物后肢功能的恢復(fù)。然而需要考慮的是倫理

2、道德方面的局限、抑制因子清除的不徹底、移植物來(lái)源的狹窄以及治療方案的單一性使其難以有效徹底的針對(duì)諸多不利因素等，這些困難成為治療脊髓損傷修復(fù)的瓶頸問(wèn)題。
　　 因此，探索新型的生物材料和新的治療方法避免以上問(wèn)題，為臨床提供一種更具可行性的治療，成為近年來(lái)研究脊髓損傷修復(fù)方面的熱點(diǎn)，各種新型的生物材料和新方法隨之涌現(xiàn)出來(lái)。
　　 SAPNS是近年來(lái)研究出來(lái)的一新型納米纖維材料，至今為止已有報(bào)道證實(shí)它能夠在組織修復(fù)中發(fā)揮良好

3、的作用，被認(rèn)為是組織損傷修復(fù)研究中比較具有應(yīng)用前景的生物材料之一。相比其他生物材料，它在組織損傷修復(fù)的研究中具有以下各項(xiàng)優(yōu)勢(shì):
　　 ①良好的組織相容性:不會(huì)因相鄰組織的排異反應(yīng)而影響新組織的結(jié)構(gòu)功能。
　　 ②良好的生物降解性:生物材料在完成支架的作用后應(yīng)能充分降解，降解產(chǎn)物能夠被組織吸收，降解率應(yīng)基本與組織細(xì)胞的生長(zhǎng)率相適應(yīng)。
　　 ③具有三維結(jié)構(gòu):納米材料可形成三維立體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)可提供更大的空間，利于細(xì)

4、胞外基質(zhì)的沉積、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和O2的進(jìn)入、代謝產(chǎn)物的排出，更有利于再生神經(jīng)的長(zhǎng)入。
　　 ④可塑性:由于其膠凍狀的特性，移植到體內(nèi)后能隨著損傷區(qū)的大小改變其形態(tài)，更好的契合損傷腔。
　　 ⑤不會(huì)引起明顯的免疫排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，能將攜帶生物致病源和污染的風(fēng)險(xiǎn)降到最低，無(wú)細(xì)胞毒性。SAPNS能很好的修復(fù)中樞神經(jīng)損傷區(qū)及促進(jìn)神經(jīng)再生。并且具有良好的緩釋作用，可作為緩釋材料在損傷區(qū)給藥。
　　 現(xiàn)今的各種研究都表明RhoA

5、在脊髓損傷修復(fù)中具有關(guān)鍵性的意義。RhoA是隸屬于Ras超家族的一種小分子GTPase，以結(jié)合GDP（無(wú)活性）和GTP（有活性）的形式發(fā)揮主要的分子開(kāi)關(guān)作用，是所有真核細(xì)胞細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的調(diào)節(jié)因子。在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育階段，它的表達(dá)能夠促進(jìn)神經(jīng)元的遷移和突起的生長(zhǎng)，而在成熟神經(jīng)元中幾乎不表達(dá)。當(dāng)神經(jīng)元損傷后1-3d，RhoA表達(dá)開(kāi)始輕微升高，1w達(dá)到高峰，可持續(xù)表達(dá)3w以上，并且能被激活。研究發(fā)現(xiàn)RhoA在神經(jīng)元受損后的重新高表達(dá)以及激活

6、是中樞神經(jīng)再生困難的重要原因之一。
　　 目前已知的抑制中樞神經(jīng)再生的相關(guān)因子大部分通過(guò)激活其下游的Rho信號(hào)通路而發(fā)揮作用。脊髓損傷后RhoA的重新高表達(dá)及其激活可導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)錐的塌陷，從而使受損神經(jīng)元凋亡，這是導(dǎo)致脊髓損傷后中樞神經(jīng)再生困難的最主要原因。因此，設(shè)法降低受損神經(jīng)元的RhoA表達(dá)或抑制其激活就有可能為促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)提供一個(gè)新的治療方法。
　　 RhoA抑制劑CT04能有效的把高表達(dá)RhoA從有活性的GT

7、P形式逆轉(zhuǎn)化成無(wú)活性的GDP形式，從而使損傷后高表達(dá)的RhoA失去活性后無(wú)法發(fā)揮其抑制軸突生長(zhǎng)的作用。目前，已有不少關(guān)于使用RhoA抑制劑的報(bào)道。其中對(duì)中樞神經(jīng)使用的方法主要有2種:即局部微量注射和靜脈注射。然而局部的微量注射會(huì)使神經(jīng)組織受到二次損傷，靜脈注射則用藥量大且很難避免全身副作用。因此迫切需要探索一種更加可行的用藥方法。
　　 本研究在建立脊髓全橫斷損傷模型的基礎(chǔ)上，于損傷處移植含有RhoA抑制劑CT04和SAPNS的

8、復(fù)合材料，針對(duì)前述的中樞神經(jīng)修復(fù)困難各種復(fù)雜因素，以期望在修復(fù)脊髓損傷處的同時(shí)緩釋CT04，抑制高表達(dá)RhoA的激活，從而探索出一種相對(duì)修復(fù)脊髓損傷后結(jié)構(gòu)與功能的新方法。
　　 本研究可分為兩個(gè)部分。
　　 第一部分:脊髓損傷模型的建立以及移植材料的構(gòu)建和移植。
　　 昆明小鼠，雌性，74只，12周齡，30-35g;動(dòng)物的分組和每組數(shù):假手術(shù)組(sham)12只，生理鹽水組(saline)20只， SAPNS組2

9、0只， SAPNS+CT04組20只，另2只用于移植SAPNS+Dextran。
　　 取一管RhoA抑制劑(CT04)，把粉末狀于10000轉(zhuǎn)/5min高速離心后加20μl50％甘油，配成濃度為1μg/μl，利用吹打及震蕩的方法充分溶解，后用8000轉(zhuǎn)/3min高速離心，無(wú)菌環(huán)境下分裝每瓶2μl，于-20度凍存。每次取2μlCT04以及13μlSAPNS，于干凈的培養(yǎng)皿中迅速均勻混合。后置于DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基溶液

10、中室溫下孵化10min，使SAPNS充分凝固，SAPNS組的材料則用2μl的50％甘油替代CT04，其他步驟同上，移植材料共15μl。整個(gè)操作在相對(duì)無(wú)菌條件下進(jìn)行。
　　 實(shí)驗(yàn)組昆明小鼠，用1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為30mg/kg。Sham組在麻醉后于小鼠背側(cè)T8-10位置打開(kāi)錐板，僅僅暴露脊髓。其他各組則需要在暴露同一位置脊髓后進(jìn)一步用顯微手術(shù)剪剪開(kāi)硬脊膜，于T9位置垂直切除長(zhǎng)度為1mm的一段脊髓，完全掏空損傷腔。SA

11、PNS+CT04組，SAPNS組和saline組分別在切除脊髓后形成的損傷腔內(nèi)填充上述構(gòu)建的移植材料或者等量15μl的生理鹽水，然后逐層縫合。
　　 移植入SAPNS+Dextran的2只小鼠在手術(shù)后1w取材，取材部位脊髓為T6-11，后做冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，記錄Dextran進(jìn)入脊髓神經(jīng)元的情況。結(jié)果顯示，Dextral雖大部分仍集中在損傷區(qū)，但是也有一部分順利被脊髓神經(jīng)元軸突攝取。由此可以得出結(jié)論，SAPNS

12、能夠作為一個(gè)橋梁對(duì)其中所混的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入損傷脊髓具有緩釋作用。
　　 對(duì)各移植組動(dòng)物12w后進(jìn)行灌注固定切片，各組隨機(jī)抽取幾張做HE染色，鏡下觀察SAPNS與宿主的組織相容性及其對(duì)損傷脊髓結(jié)構(gòu)的修復(fù)效果。結(jié)果顯示，生理鹽水組存在較大的損傷區(qū)空洞，而SAPNS組和CT04+SAPNS組宿主與移植物銜接良好，無(wú)明顯空腔。
　　 第二部分:脊髓損傷的修復(fù)效果評(píng)定。
　　 對(duì)實(shí)驗(yàn)所得計(jì)量資料電生理的潛伏期和峰峰值、軸突密

13、度、ED1細(xì)胞數(shù)量、TUNEL細(xì)胞數(shù)量使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-WayANOVA);BMS評(píng)分值用1w用兩個(gè)樣本的T檢驗(yàn)，6w和12w用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。
　　 手術(shù)后1w、6w、12w對(duì)剩下小鼠進(jìn)行爬網(wǎng)格測(cè)驗(yàn)和BMS評(píng)定。各組各取5只小鼠12w后在橫斷處遠(yuǎn)端注射熒光金(FG)再存活7d，Sham組取5只，其他各取8只小鼠12w后測(cè)皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(CMEP)然后取材

14、、切片并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測(cè)。
　　 結(jié)果顯示:
　　 1.移植物能夠促進(jìn)脊髓橫斷處結(jié)構(gòu)修復(fù)和后肢功能的恢復(fù);
　　 2.各移植組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，脊髓損傷區(qū)近端、腦干紅核及大腦軀體感覺(jué)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)內(nèi)錐體細(xì)胞層有少量的FG標(biāo)記神經(jīng)元，其中CT04+SAPNS組的FG標(biāo)記神經(jīng)元多于單純SAPNS移植組;
　　 3.各移植組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比，CMEP的潛伏期減小，峰峰值增大;
　　 4.各移植組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組相比