蟲草ITS序列分子進化分析及其復(fù)合營養(yǎng)液的體外細胞作用研究.pdf

1、藥用真菌用于治療人類疾病有著悠久的歷史，由于其具有高蛋白、低脂肪、低熱量以及獨特的優(yōu)越性，近年來更被國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。蟲草、靈芝與猴頭三種珍稀的食藥用真菌，據(jù)研究顯示具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、調(diào)節(jié)新陳代謝等多種藥用。但野生蟲草與猴頭資源稀缺，為更好地開發(fā)藥用真菌資源，使用液體發(fā)酵菌絲體已成為替代資源的一條重要的途徑。但由于蟲草的復(fù)雜生活史，以及系統(tǒng)發(fā)育地位的混亂，如何正確地鑒定蟲草無性型已成為蟲草液體發(fā)酵并開發(fā)其藥用功效的首要條件。

2、
　　 本研究采用PCR及DNA測序的方法，對13株不同產(chǎn)地的蟲草分離菌ITS區(qū)序列進行分析，確認ITS作為條形碼的可行性，成功鑒定了供試分離菌。同時采用生物信息學(xué)方法對Genbank中收集的蟲草屬36個物種以及肉座菌目的191個物種的ITS區(qū)序列進行多序列比對，構(gòu)建進化樹等分析，探討蟲草的系統(tǒng)發(fā)育地位及與相關(guān)物種的近緣關(guān)系。隨后，本研究通過對已鑒定的蟲草無性型，猴頭，靈芝三種藥用真菌進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，并通過破碎，膠體磨粉碎，超

3、聲破壁等方法制備復(fù)合營養(yǎng)液，并通過DNS法測定了營養(yǎng)液中的多糖含量。為了探討復(fù)合營養(yǎng)液的藥理作用，本研究采用MTT細胞活力測定，DNA梯狀電泳，熒光染色等方法分析了復(fù)合營養(yǎng)液對MG63，Hela，HepG-2等體外腫瘤細胞凋亡的誘導(dǎo)作用。另外研究了復(fù)合營養(yǎng)液對過氧化氫造成的PC12細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用，并測定其NO水平和LDH活性的變化。主要研究結(jié)果：
　　 1.通過ITS條形碼鑒定分析，確認了CM-m5、CM-m7、CM

4、-m1、CM-m3和CM-m8為蛹蟲草的無性型；CS-2和CS-k1為蝙蝠蛾擬青霉。
　　 2.成功制備了蟲草復(fù)合營養(yǎng)液，采用DNS方法測定還原糖與總糖的方法測定了營養(yǎng)液中含有的多糖含量為22.52mg/ml，并考察了DNS法的穩(wěn)定性，重復(fù)性及加樣回收率。
　　 3.復(fù)合營養(yǎng)液能夠有效抑制MG63、Hela等腫瘤細胞的增殖，并呈劑量依賴性，同時在高劑量營養(yǎng)液的作用下，可抑制HUVEC細胞的增殖，而在低劑量作用時，營養(yǎng)液可

5、促進其生長，但對HepG-2肝癌細胞的抑制作用在48小時內(nèi)并未體現(xiàn)。通過熒光雙染以及DNALadder等指標檢測凋亡作用，顯示復(fù)合營養(yǎng)液可通過誘導(dǎo)MG63細胞凋亡從而達到抗腫瘤的效果。
　　 4.使用過氧化氫對PC12細胞進行造模處理，最終確定最佳的H2O2濃度為400μM，作用時間為24小時。通過MTT實驗確認了當加藥濃度在5％以下時為復(fù)合營養(yǎng)液對PC12細胞的安全濃度，在此基礎(chǔ)上考察復(fù)合營養(yǎng)液對神經(jīng)細胞氧化應(yīng)激的保護作用，結(jié)

6、果表明復(fù)合營養(yǎng)液能夠有效地降低細胞上清LDH活性及NO含量，有效地減輕氧化損傷。
　　 主要結(jié)論：
　　 1.ITS序列可以作為蟲草條形碼對蟲草及其相關(guān)物種進行鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育分析，并從分子水平上驗證蟲草與其無性型之間的對應(yīng)關(guān)系，確認了蟲草屬被劃分為肉座菌目一員的說法，但與蟲草與麥角菌科的從屬關(guān)系相矛盾。
　　 2.復(fù)合營養(yǎng)液含有較為豐富的蕈菌多糖，在一定劑量內(nèi)能夠有效抑制腫瘤細胞及與腫瘤生長有關(guān)的血管內(nèi)皮細胞的