丁香假單胞菌鐵載體PYOVERDINE介導(dǎo)的殺秀麗隱桿線蟲活性與鐵在致病性中的作用.pdf

1、丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）是一種已被深入研究的革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌，但該菌對動物如秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的致病性最近也已被研究證實。鐵是自然環(huán)境中最豐富的元素之一，但其生物利用率一直相對較低。多種不同的微生物類群已經(jīng)發(fā)展出具有對鐵具有高親和性能的鐵吸收系統(tǒng)，包括血紅素攝取系統(tǒng)、鐵載體系統(tǒng)和細(xì)胞膜受體等。假單胞菌屬（Pseudomonas）的主要鐵載體是pyoverdi

2、ne。它是一種低分子量、高親和力的鐵清除熒光分子，僅在鐵限制條件下由熒光假單胞細(xì)菌群產(chǎn)生。除了具有對鐵的吸收性能，鐵載體pyoverdine也可以作為細(xì)菌毒素。本學(xué)位論文主要研究了基于液體培養(yǎng)條件下的線蟲致病模型中，在鐵限制條件下丁香假單胞菌野生菌株MB03和秀麗隱桿線蟲之間的相互作用，以及鐵載體pyoverdine在丁香假單胞菌致病性中的作用。
　　鑒于銅綠色假單胞菌（Pseudomonas aerugionosa）PAO1菌株

3、已經(jīng)鑒定出幾乎所有與pyoverdine生物合成和分泌相關(guān)的基因，使用PAO1菌株的pyoverdin基因簇作為參考序列，利用在線工具Anti-SMASH對丁香假單胞菌MB03基因組中pyoverdine編碼基因簇進(jìn)行了預(yù)測和定位分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)丁香假單胞菌MB03中缺少5個與PAO1中的直系統(tǒng)同源基因(pvdX,pvdY,pvdA，pvdF和fpvI)。在這些基因中，pvdX和pvdY編碼調(diào)節(jié)蛋白;pvdA和pvdF編碼合成N5-

4、甲?；?N5羥基鳥氨酸殘基所需的酶，這些殘基存在于PAO1的pyoverdine的肽鏈中。但在MB03的pyoverdine基因簇中也存在一種為PAO1中所沒有的基因，即syrP。推測syrP的編碼產(chǎn)物可能參與存在于MB03-PVD肽鏈中的羥基天冬氨酸殘基的β-羥基化作用此外，在PAO1中，兩個Sigma因子編碼基因pvdS和fpvI分別參與pyoverdine生物合成和pyoverdine受體FpvA的激活，但是，在丁香假單胞菌MB0

5、3的基因組中不存在fpvI,而是在fpvA基因的前面有一個pvdS IS基因框，表明在丁香假單胞菌MB03中的pvdS可能參與fpvA基因的轉(zhuǎn)錄。
　　Pyoverdine在結(jié)構(gòu)上由3個不同的結(jié)構(gòu)域組成，即生色團(tuán)（最保守的部分）、肽鏈（最可變部分）和側(cè)鏈（羧酸衍生物）。在MB03的鐵載體pyoverdine基因簇中的非核糖體基的多肽合成酶(NRPS)基因編碼參與pyoverdine的肽鏈和發(fā)色團(tuán)部分合成的一種大分子量酶。通過NRP

6、S預(yù)測因子對丁香假單胞菌MB03的5個推定的NRPS基因進(jìn)行計算機(jī)模擬表征表明，MB03-PVD的肽鏈呈線性形式并且由L-1ys，D-Asp，L-Thr，L-Thr，L-Ser，D-Asp和L-Ser。經(jīng)測定鐵載體pyoverdine特定光吸收值，發(fā)現(xiàn)MB03產(chǎn)生的pyoverdine與培養(yǎng)基中的Fe3+濃度成反比，而鐵對于pyovidine生產(chǎn)的臨界抑制濃度約為20μmol/L。
　　通過使用RecTE重組系統(tǒng)來進(jìn)行pyover

7、dine生物合成2個相關(guān)基因的中斷，獲得了相應(yīng)基因中斷突變株ΔpvdD和ΔpvdJ。由于pyoverdine是一種分泌的非核糖體多肽，所以可通過LC-MS和熒光光吸收測定來鑒定中斷菌株是否喪失產(chǎn)鐵載體pyoverdine的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩株突變株的破碎細(xì)胞濾液均缺乏pyoverdine特征性的黃綠色熒光，表明突變株未能產(chǎn)生pyoverdine。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，2株突變株也缺乏pyovine的特征峰，而野生型MB03產(chǎn)生了具有1123.41

8、2m/z和1142.4165m/z的兩類pyovidine。
　　為調(diào)查鐵在MB03對線蟲致病性中的作用，在添加或不添加鐵的M9培養(yǎng)基中來培養(yǎng)MB03菌株，然后進(jìn)行對秀麗隱桿線蟲的殺蟲生物測定。由于Pyoverdine也有助于在丁香假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的幾種常見致病因子(如AHL，EPS和Tabtoxin)的產(chǎn)生，因此，pyoverdine有可能在培養(yǎng)過程中由于鐵在培養(yǎng)基濃度的不同從而調(diào)節(jié)了細(xì)胞毒性、并導(dǎo)致對線蟲殺蟲效果的差異性。為驗證

9、這一假設(shè)，將過夜MB03培養(yǎng)物產(chǎn)生的濾液分成兩半，其中之一添加額外的100μmol/L鐵并培養(yǎng)過夜。生物測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生菌株MB03導(dǎo)致供測線蟲的顯著性致死(p=0)，但通過在M9中添加外源鐵（100μmol/L）或通過在MB03過夜培養(yǎng)物中直接添加外源鐵的細(xì)胞濾液可在一定程度上減小致死率。此外，液相生物測定的致死效應(yīng)通常發(fā)生在培養(yǎng)30h之后，因此，足夠的培養(yǎng)時間對于細(xì)菌的致死作用也是進(jìn)行生物測定時要考慮的。
　　將基因中斷突變

10、株ΔpvdD和ΔvdJ與野生菌株MB03在貧鐵的M9培養(yǎng)基中生長后進(jìn)行液相殺蟲生物測定，另外，使用純化鐵載體pyoverdine進(jìn)行相應(yīng)生物測定，因為推測pyoverdine可能是具有殺蟲活性的MB03濾液中的一種作用導(dǎo)致線蟲死亡的活性因子。在液相生物測定中使用的純化pyoverdine的濃度與在MB9中在48h內(nèi)在M9培養(yǎng)基中產(chǎn)生的pyoverdine的濃度相當(dāng)。測量暴露于各種濾液的線蟲的相對死亡率，結(jié)果如預(yù)期相符:與M9和大腸桿菌（

11、Escherichia coli OP50濾液相比，MB03濾液顯示顯著的殺死作用(p=0)，而兩種突變株的殺蟲試驗都沒有發(fā)現(xiàn)線蟲死亡。
　　為了證實突變體的減毒活性是由于缺乏pyoverdine產(chǎn)生的，將純化的pyoverdine加入突變體中以測量與野生型相當(dāng)?shù)南鄬λ劳雎剩Y(jié)果證實pyoverdine是導(dǎo)致線蟲死亡的細(xì)菌濾液中的活性因子。通過pyoverdine生物合成缺陷的突變株的減毒活性、以及兩突變株在添加純化的pyover

12、dine后又可殺線蟲的實驗結(jié)果可以證實，pyoverdine在MB03介導(dǎo)的液相殺蟲實驗中是決定殺蟲活性的重要因素。此外，通過測量MB03和兩種突變株的生長曲線，發(fā)現(xiàn)突變株在貧鐵M9培養(yǎng)基中生長緩慢。因此，這表明pyoverdine對丁香假單胞菌MB03生長也是至關(guān)重要的。
　　總之，本研究結(jié)果表明，丁香假單胞菌MB03具有產(chǎn)生pyoverdine的遺傳潛力。通過RecTE重組系統(tǒng)構(gòu)建獲得2株pyoverdine生物合成缺陷的基因