利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)檢測食源性致病微生物的研究與應(yīng)用.pdf

1、食源性致病菌是指一類以食品、糧食等為傳播介質(zhì)的可以引起人類生病的病原體和病菌。本文主要是針對常見的可以引起人類疾病的細(xì)菌，重點(diǎn)關(guān)注副溶血性弧菌、單核增生李斯特氏菌和志賀氏菌。
　　傳統(tǒng)的方法是初步增菌培養(yǎng)，選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，分離純化，然后利用其生化特點(diǎn)進(jìn)行生化試驗(yàn)確認(rèn)，方法比較繁瑣，用時較長，而且準(zhǔn)確性和靈敏度都不是很高。為解決這個問題，本試驗(yàn)利用核酸擴(kuò)增技術(shù)，特異性的擴(kuò)增目標(biāo)菌的特異性序列，然后通過電泳的方式檢測擴(kuò)增的序列條帶大

2、小是否符合靶序列的大小。
　　目前較為成熟的核酸擴(kuò)增方法是PCR核酸擴(kuò)增技術(shù)，但是PCR核酸擴(kuò)增技術(shù)也有一些缺點(diǎn)，PCR核酸擴(kuò)增技術(shù)需要目標(biāo)序列在幾個溫度間切換，使堿基不斷打開和連接，所以需要用到專門的PCR儀器，花費(fèi)較高。
　　滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)是近兩年興起的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、恒溫?cái)U(kuò)增的特點(diǎn)，極具研究和應(yīng)用價值。
　　本課題的目的是充分利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)的特點(diǎn)，將這種檢測技術(shù)應(yīng)用到副溶血性

3、弧菌、單核增生李斯特氏菌和志賀氏菌的檢測中，開發(fā)一種新型的針對這幾種致病菌的快速檢測技術(shù)，改善和解決日常檢測中遇到的問題。
　　在本課題中，根據(jù)滾環(huán)擴(kuò)增的原理，設(shè)計(jì)了特異性引物和鎖式探針，鎖式探針是滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)中特有的技術(shù)，其原理是，在鎖式探針的兩端有與目標(biāo)序列特異性結(jié)合的序列，這樣就可以讓鎖式探針在與目標(biāo)序列結(jié)合后形成環(huán)狀，然后用DNA連接酶使鎖式探針兩端結(jié)合，這樣就形成了一條環(huán)形單鏈DNA。然后用設(shè)計(jì)的引物與這條環(huán)狀DNA結(jié)合

4、，進(jìn)行DNA核酸的擴(kuò)增，這個過程只需要在一個溫度下即可進(jìn)行，最終得到所需的擴(kuò)增序列，利用核酸電泳技術(shù)，觀察到核酸的長度大小，據(jù)此判斷擴(kuò)增是否成功，如果擴(kuò)增成功即證明核酸樣品中含有目標(biāo)菌的特異性序列，即證明檢測的樣品是陽性。
　　研究結(jié)果顯示本課題構(gòu)建的RCA檢測體系具有很好的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性，適用于副溶血性弧菌、單核增生李斯特氏菌、志賀氏菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測和鑒定。并研制成可以應(yīng)用的試劑盒。用試劑盒與傳統(tǒng)方法相比較后