谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶修飾蛋白質(zhì)藥物及其固定化研究.pdf

1、微生物來(lái)源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（EC2.3.2.13，microbial transglutaminase，mTG）催化肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基（?；w或氨基受體）與伯氨化合物（?；荏w或氨基供體）之間進(jìn)行?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分子交聯(lián)、分子修飾，是一種用途非常廣泛的酶。為了解決無(wú)法定點(diǎn)修飾蛋白質(zhì)藥物 Lys殘基的難題，本文突破mTG僅定點(diǎn)修飾蛋白質(zhì)Gln殘基的限制，以mTG作為生物催化劑，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)藥物（細(xì)胞色素C、尿酸酶

2、）Lys殘基的定點(diǎn)修飾；為了將mTG從催化蛋白修飾反應(yīng)的溶液體系中回收，并克服傳統(tǒng)固定化方法的底物擴(kuò)散限制問(wèn)題，本文以溫度敏感材料為載體制備出可逆溶解-析出的固定化mTG，提高了固定化酶催化大分子底物反應(yīng)的反應(yīng)效率。針對(duì)上述兩個(gè)問(wèn)題，本文具體開(kāi)展的研究工作如下：
　　首先，對(duì) mTG的酶學(xué)性質(zhì)展開(kāi)研究，考察還原劑、金屬離子、溫度、pH值等因素對(duì)mTG活力的影響。結(jié)果表明：還原劑的存在有利于其活力表達(dá)。鎂離子對(duì)mTG有激活作用，鐵離

3、子對(duì)酶的活力有顯著抑制作用，鈉離子在濃度較低（2 mM）時(shí)對(duì)酶的活力具有促進(jìn)作用，但其濃度較高時(shí)，反而對(duì)酶有輕微抑制作用，鈣離子對(duì)酶活力有輕微抑制作用。mTG的最適溫度為50-55 ℃左右，在40 ℃以下有很好的熱穩(wěn)定性，在40℃以上熱穩(wěn)定性比較差。酶的最適pH值在6-7左右，在6-8范圍內(nèi)，酶的酸堿穩(wěn)定性最好。mTG催化雙底物反應(yīng)符合乒乓反應(yīng)機(jī)制。
　　在mTG酶學(xué)研究的基礎(chǔ)上，探索利用mTG的催化作用實(shí)現(xiàn)聚乙二醇（PEG）定點(diǎn)

4、修飾蛋白質(zhì)藥物（細(xì)胞色素C、尿酸酶）Lys殘基的可行性。結(jié)果表明：甲氧基聚乙二醇氨（mPEG-NH2）與 N-芐氧羰基-L-谷氨酰胺甘氨酸（CBZ-QG）共價(jià)結(jié)合后生成的CBZ-QG-mPEG，可以作為mTG的?；w?；趍TG對(duì)Lys殘基的特異選擇性，在mTG的催化作用下，CBZ-QG-mPEG與細(xì)胞色素C（Cyt C）、尿酸酶特定位點(diǎn)的Lys殘基結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞色素C（Cyt C）、尿酸酶的PEG定點(diǎn)修飾。對(duì)mTG催化Cyt C修

5、飾的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化條件下，酶法修飾Cyt C的轉(zhuǎn)化率達(dá)到76.5％。修飾后的Cyt C仍具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，而且活力與天然Cyt C相比略有提高。對(duì)mTG催化尿酸酶修飾的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后酶法修飾尿酸酶的轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%。修飾后尿酸酶的活力比修飾前尿酸酶活力高，且修飾后尿酸酶的溶解性能顯著改善。修飾后尿酸酶的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性明顯提高。這些性質(zhì)的改善更有利于其臨床應(yīng)用。與化學(xué)修飾法相比，酶催化法修飾Cyt

6、 C、尿酸酶，修飾產(chǎn)物只有一種，而化學(xué)法修飾產(chǎn)生多種不同修飾度的不均一修飾產(chǎn)物。
　　通過(guò)研究mTG催化蛋白質(zhì)分子（酪蛋白、過(guò)氧化氫酶）的交聯(lián)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了凝膠的合成和酶蛋白的酶法交聯(lián)。結(jié)果表明：mTG能催化酪蛋白發(fā)生分子交聯(lián)生成大分子聚合物。凝膠形成的決定性因素為酪蛋白濃度，而酶的用量對(duì)凝膠的形成速度有重要影響，酶用量越多，凝膠形成越快。SDS-PAGE分析表明，mTG也能催化過(guò)氧化氫酶（CAT）發(fā)生分子交聯(lián)生成大分子聚合物。游離

7、CAT的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性均比較差，而聚合后CAT的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性顯著提高。
　　分別以Affi-Gel?102微球和溫度敏感的pNIPAM為載體實(shí)現(xiàn)mTG的固定化，并對(duì)兩種固定化酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用方面的差異進(jìn)行比較。結(jié)果表明：以Affi-Gel?102為載體的固定化酶對(duì)大分子底物的親和性顯著降低。固定化到載體Affi-Gel?102上之后，mTG仍然可以催化蛋白質(zhì)分子的聚合反應(yīng)、Cyt C和尿酸酶的修飾反應(yīng)，而且能很容

8、易地從溶液中分離出來(lái)，但與游離酶相比，催化效率降低?？赡嫒芙?析出的pNIPAM作為載體固定化mTG，具有對(duì)溫度敏感的可逆溶解-析出特性，其低臨界溶解溫度（LCST）為39 ℃左右。mTG-pNIPAM對(duì)大分子底物的親和性比游離酶略有降低，但遠(yuǎn)大于Affi-Gel?102固定化酶。mTG-pNIPAM催化蛋白質(zhì)分子交聯(lián)反應(yīng)、Cyt C修飾反應(yīng)的催化效率大于以Affi-Gel?102為載體的固定化酶的催化效率，而且通過(guò)加熱和離心可以實(shí)現(xiàn)酶