吸水鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活化機(jī)理研究.pdf

1、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，EC2.3.2.13，簡(jiǎn)稱TGase）能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，從而改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性，在食品、生物醫(yī)藥、組織工程、紡織等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。鏈霉菌TGase是酶原(Pro-TGase)經(jīng)活化而成的，但是關(guān)于鏈霉菌TGase的活化機(jī)理還不清楚。為了深入地研究吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)產(chǎn)TGase的活化機(jī)理，本論文對(duì)S．h

2、ygroscopicus發(fā)酵產(chǎn)生的Pro-TGase和TGase的高效分離純化及TGase的活化過(guò)程進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．在培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的Cu2+，Mn2+，Zn2+，F(xiàn)e2+,Co2+五種金屬離子，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，Cu2+，Mn2+,Zn2+對(duì)S．hygroscopicus產(chǎn)TGase有明顯的促進(jìn)作用，并且確定0.05 mmol/LCu2+是最適合添加的離子。確定了S．hygroscopicu

3、s利用優(yōu)化培養(yǎng)基液體培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)60h時(shí)Pro-TGase可以完全轉(zhuǎn)化成TGase。
　　 2．利用硫酸銨沉淀和陰離子交換層析以及凝膠過(guò)濾層析對(duì)S．hygroscopicus發(fā)酵上清液中的Pro-TGase和TGase進(jìn)行了高效分離純化，并得到兩種活性較高而電荷量不同的TGase(TGaseA和TGaseB)。本研究是首次利用陰離子交換層析法對(duì)吸水鏈霉菌Pro-TGase和TGase分離純化。
　　 3．通過(guò)Hipr

4、ep1610 phenyl FF柱和LC-MS以及CD譜對(duì)兩種TGase的疏水性、天然相對(duì)分子質(zhì)量以及二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TGase A和TGase B的疏水性、相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)結(jié)構(gòu)均存在差異。研究了兩種TGase的動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)兩種TGase的Vmax、Km和kcat差異也很大。
　　 4．測(cè)定了S． hygroscopicus來(lái)源的Pro-TGase的N端氨基酸序列為ASGGDG，TGase A和TGase B的N端前五個(gè)

5、氨基酸序列均為DAADE。S．hygroscopicus來(lái)源Pro-TGase的N端氨基酸序列與已報(bào)道的S． cinnamoneus、S．fradiae、S．netropsis來(lái)源的相似性很高，但TGase的N端序列與這三種鏈霉菌來(lái)源的相似性卻不高。本研究是首次對(duì)S．hygroscopicus來(lái)源的TGase的N端氨基酸序列進(jìn)行報(bào)道。
　　 5．對(duì)純化后的Pro-TGase與TGase A和TGase B的相互作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，

6、Pro-TGase可以被自身的TGase B活化但不能被TGase A活化。熱處理后的Pro-TGase對(duì)TGase A和TGase B的活性均有抑制作用，而且對(duì)TGase B的抑制作用更顯著。本研究是首次對(duì)S． hygroscopicus來(lái)源的Pro-TGase可以被自身的TGase活化進(jìn)行報(bào)道。
　　 6．分別對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)了TGase的活化機(jī)理：S．hygroscopicus經(jīng)過(guò)24h的培養(yǎng)后P