蛋白質(zhì)藥物的peg化學(xué)修飾

1、蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾胡 濤,中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,1.迅速被體內(nèi)酶降解2.腎小球過濾清除3.抗原－抗體反應(yīng)4.溶解度差導(dǎo)致沉淀,蛋白質(zhì)藥物在使用中出現(xiàn)的問題,體外聚乙二醇修飾（PEG化）,(1)增大藥物分子量，避免被腎小球過濾(2)阻礙蛋白酶的降解作用(3)屏蔽藥物的免疫位點(diǎn)(4)增加藥物在體液中的溶解度(5)與藥物間的化學(xué)鍵在體內(nèi)隨時(shí)間水解，緩慢釋放藥物,,,,+,蛋白或多肽,

2、偶聯(lián)物,聚乙二醇,,,CH3(-O-CH-CH)n-OH,生物醫(yī)藥生物能源生物材料生物化學(xué)品其它產(chǎn)品,,生化工程（生物化學(xué)工程，Biochemical Engineering）,目 錄,PEG修飾的國內(nèi)外研究進(jìn)展 PEG修飾劑的研發(fā) PEG修飾方法 PEG修飾工藝的優(yōu)化 PEG修飾產(chǎn)物的質(zhì)量控制,一、PEG修飾的國內(nèi)外研究進(jìn)展,國際上PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展,美國Rutgers大學(xué)Davis教授70年代的工作甲氧基P

3、EG的應(yīng)用美國Enzon公司美國最早從事PEG修飾蛋白質(zhì)藥物的公司美國Shearwaters公司各種PEG修飾劑的生產(chǎn)商美國羅氏、先靈寶雅、安進(jìn)PEG藥物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：輝瑞、默克、葛蘭素史克、施貴寶。。。,國內(nèi)PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展,國家863重大機(jī)密項(xiàng)目：人工血液代用品的研制，1997-2000中國科學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目：血液代用品和血液凈化，2001-2005國家重大科技專項(xiàng)課題《創(chuàng)新藥物和中

4、藥現(xiàn)代化》：長效基因工程蛋白質(zhì)和多肽制劑關(guān)鍵技術(shù)，2002-2005國家863重點(diǎn)項(xiàng)目課題：核酸和多肽的修飾和劑型化技術(shù)，2007-2010PEG修飾血紅蛋白：I 期臨床（中科院過程所、凱正公司）PEG修飾G-CSF：III 期臨床（格蘭百克）,修飾粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）延長半衰期修飾人腫瘤壞死因子消除副作用修飾白介素I受體拮抗劑（rhIL-1Ra） 延長半衰期修飾牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗

5、腫瘤活性修飾超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修飾天冬酰氨酶（Aspartase） 克服免疫原性提高半衰期修飾人干擾素（IFN）提高半衰期修飾血紅蛋白（Hb）血液代用品修飾胰島素提高半衰期,我國在PEG修飾蛋白質(zhì)方面的一些工作,二、PEG修飾劑的研發(fā),Sc-PEG 專利分析,以PEG-OH為原料的必然途徑,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH + 光氣 + NHS,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)

6、nO-C-O-N + NH2——G-CSF,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NH——G-CSF,O,單鏈修飾：,,,(SC-PEG),Roche公司的長效干擾素產(chǎn)品專利分析,同樣是以PEG-OH為原料的必然途徑,雙鏈修飾：,,,,,新的修飾策略,采用新方法制備新的修飾劑,以PEG-COOH（CM-PEG)為原料的必然途徑，已獲專利,CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OH,CH

7、3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N + NH2——G-CSF,單鏈修飾：,,,CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH——G-CSF,O,(CM-PEG),我們的策略,以PEG-COOH為原料的必然途徑,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH,,O,O,O,雙鏈修飾：,,CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH + Lysi

8、ne,O,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-,O,(CH2)3,CH2,CH-C-O-N,+ NH2——IFN,,,,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH,O,O,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-,O,(CH2)3,CH2,CH-C-NH,——IFN,,,,,1、PEG修飾劑的批量制備取得了成功,,取 得 的 主 要 進(jìn) 展,聚乙二醇修飾劑產(chǎn)品,三、藥用蛋白的PEG修飾方法,,創(chuàng)新技術(shù)（反應(yīng)

9、器技術(shù)和產(chǎn)物移走技術(shù)）,,,,,,,,,,,①振蕩反應(yīng)器,②流加反應(yīng)器,③緩釋反應(yīng)器,,,④固相反應(yīng)方式,⑥膜耦合反應(yīng)方式,,,,⑤雙水相反應(yīng)方式,,Q. Yun, R. Yang, T. Chen, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, 2005, 118: 67-74,中國發(fā)明專利，申請?zhí)?00510114930.0 中國發(fā)明專利，申請?zhí)?410029577,1.修飾反應(yīng)器設(shè)計(jì)—PEG-pel

10、let 反應(yīng)器,,,,2.固相吸附法制備PEG修飾蛋白,固相吸附法與液相吸附法的比較,1峰：原蛋白；2峰：單修飾蛋白； 3峰：多修飾蛋白,PEG-INF的制備過程,G-CSF,PEG-G-CSF,,,,,,,,,,,,,,,,3.PEG醛制備單修飾的藥用蛋白,粒細(xì)胞集落刺激因子 (G-CSF),MW: 18.8kd (174 amino acids) pI: 6.1,1 thiol, 1 N-terminal, 4 lysines,

11、Half life: 5 h,Weekly injection: 7 times,三批PEG30-rhG-CSF產(chǎn)品的制備,,取 得 的 主 要 進(jìn) 展,PEG化重組人生長激素，批產(chǎn)量1-10g；PEG化降纖酶，批產(chǎn)量6000支；環(huán)孢素A眼用微乳制劑，批產(chǎn)量5000支,PEG化G-CSF,2L修飾反應(yīng)器計(jì)算機(jī)程序控制批產(chǎn)量>3g生產(chǎn)周期10天,修飾和劑型化產(chǎn)品質(zhì)量達(dá)到國際先進(jìn)水平,生產(chǎn)規(guī)模產(chǎn)品質(zhì)量批次穩(wěn)定性,1

12、 2 3,1,2,3,1,2,3,(A),(B),(C),以分子量為30kDa的PEG修飾rhG-CSF為例：(A)三批產(chǎn)品的SDS-PAGE檢測圖譜(B)三批產(chǎn)品的高效凝膠過濾檢測圖譜(C)三批產(chǎn)品的園二色檢測圖譜,4. 引入巰基的方法制備PEG修飾蛋白,,,(2) PEGylation,S,,,NH,+,(1) Thiolation,HS-(CH2)3-C-NH-Hb,,,,,,,,,N,,,,O,,,O,,,PEG,

13、-S-(CH2)3-C-NH-Hb,O,PEG,,,,,,,N,,,,,,O,,2-iminothiolane,NH2-Hb,,Sangart公司是一家私營的生物制藥公司，主要從事氧載體的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化,Hemospan -- MP4,Phase I – Sweden Status: CompletePhase Ib/II – Sweden Status: CompletePhase II – Swed

14、en Status: Complete Phase II – USA Status: Enrollment Complete Phase III – Europe Status: Enrollment Complete,該P(yáng)EG修飾產(chǎn)物的凝膠過濾分析,四、PEG修飾工藝的優(yōu)化,,PEG修飾反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化,建立反應(yīng)動力學(xué)，包括位點(diǎn)反應(yīng)動力學(xué)和蛋白分 子反應(yīng)動

15、力學(xué)，優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間 優(yōu)化反應(yīng)的pH值 優(yōu)化PEG與蛋白的摩爾比 優(yōu)化反應(yīng)體系,蛋白分子的修飾反應(yīng)動力學(xué),Weijun Li, Zhiguo Su. Quantitatively investigating monomethoxypolyethylene glycol modification of protein by capillary electrophoresis, J. Biochem. Biophys. Metho

16、ds. 2004，59: 65-74,,PEG修飾的位點(diǎn)反應(yīng)動力學(xué),PEG醛修飾藥用蛋白的優(yōu)化反應(yīng),單修飾產(chǎn)物的分離純化,P1 P2,分離產(chǎn)物分析,P1凝膠過濾分析,膜耦合修飾工藝制備PEG化藥用蛋白,五、PEG修飾產(chǎn)物的質(zhì)量控制,IEF和SDS-PAGE鑒定PEG修飾蛋白,,1,2,3,4,+,-,Iodine stain,Comassie blue stain,SDS-PAGE,IEF,1: Marker, 2: Hb

17、A, 3: ??-Hb 4: (Propyl-PEG5K)6-Hb5: (Propyl-PEG5K)6-??-Hb,1: HbA, 2: ??-Hb 3: (Propyl-PEG5K)6-Hb4: (Propyl-PEG5K)6-??-Hb,RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段,質(zhì)譜分析胰蛋白酶切片段,MALDI-TOF/TOF分析PEG修飾位點(diǎn)在Val-1(?),PEG修飾蛋白的結(jié)構(gòu)鑒定,圓二色光譜鑒定,熒光光譜鑒定,RP-HP

18、LC分析PEG修飾蛋白,蛋白質(zhì)修飾劑及其制備方法和用途,中國發(fā)明專利， ZL01141745.5 制備分枝型聚乙二醇的新方法,中國發(fā)明專利， ZL02120740.2 帶PEG長尾的蛋白質(zhì)修飾劑的制法和用途,中國發(fā)明專利， ZL031100736.8 聚乙二醇羧酸的制備方法和其用途 ,中國發(fā)明專利， ZL 200310113367.6 重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物的制備及其偶聯(lián)產(chǎn)物,中國發(fā)明專利， ZL 200410029

19、577.1 一種蛋白質(zhì)交聯(lián)劑及其交聯(lián)方法,中國發(fā)明專利， ZL 03105003.4 一種分級分離制備血紅蛋白偶聯(lián)物的方法,中國發(fā)明專利， ZL 99106228.0 一種二醇聚合物—動物血紅蛋白偶聯(lián)物的制備方法,中國發(fā)明專利， ZL 99106229.9 一種二醇聚合物—動物血清白蛋白偶聯(lián)物的制備方法,中國發(fā)明專利 ZL 00123696.2 分子量均一的聚合物血紅蛋白的制備方法,中國發(fā)明專利 ZL 01136190.5.

20、 血紅蛋白--人血清白蛋白偶聯(lián)物制備血液代用品及其制備方法,中國發(fā)明專利， ZL 03109622.0,蛋白質(zhì)修飾國家發(fā)明專利11項(xiàng)（已授權(quán)）,PEG修飾的SCI論文,Q Yun, T Chen, G Zhang, J Bi, G Ma , Z Su. A novel polyethylene glycol derivative suitable for the preparation of mono-PEGylated protein

21、. Biotech Lett, 27, 213-217, 2005 Q Yun, R Yang, T Chen, J Bi, G Ma, Z Su. Reproducible preparation and effective separation of PEGylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor with novel “PEG-pellet” P

22、EGylation mode and ion-exchange chromatography. J Biotech. 2005, 118:67-74 Q Yun, M He, W Xing, J Bi, G Ma, Z Su, A novel tetrafunctional reagent for simultaneous intramolecular and intermolecular cross-linking of bovin

23、e hemoglobin, Biotech Lett 26: 1359-1363, 2004. X Li, F Meng, G Ma , Z Su, A simple and efficient method for synthesis of carboxymethylated polyethyleneglycol. J Chem Res, In press.J Zhang, Y Zhao, Z Su, G Ma, Synthesi

24、s of Monomethoxy Poly(ethylene glycol) without Diol Poly(ethylene glycol), J Appl Polym Sci, 105, 3780–3786 (2007).J Zhang, Z Su, G Ma, Synthesis and Characterization of Hetetotelechelic poly(ethylene glycol)s with amin

25、o acid at one end and hydroxyl group at another end, J Appl Polym Sci, in press. C Zheng, J Bi, G Ma, Z Su, Polyethylene Glycol Improves Conjugation of Bovine Hemoglobin and Human Serum Albumin in a Controlled Ratio, Ar

26、tificial Cells, Blood Substitutes, and Biotechnology, 35: 568–584, 2007. C Zheng, G Ma, Zhiguo Su, Native PAGE eliminates the problem of PEG-SDS interaction in SDS-PAGE and provides an alternative to HPLC in characteriz