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文檔簡介
1、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(Percutaneous coronary intervention,PCI)是急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者介入治療的一個重要組成部分。然而,血運重建使心肌組織遭受心肌缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)損傷從而導致不良的臨床結果。心肌細胞凋亡是心肌缺血/再灌注損傷的重要機制之一,越來越多的證據(jù)表明,糖原合成酶激酶-3β(Glycog
2、en synthase kinase3 beta,GSK-3β)在心肌細胞凋亡過程中起到關鍵作用,因此,通過干預GSK-3β成為對抗心臟I/R損傷的新策略。GSK-3屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,在心臟各種病理過程如心肌肥厚和缺血性損傷中發(fā)揮著重要的作用。GSK-3由兩個不同的基因編碼亞型α和β組成并廣泛表達。許多研究證實,在心臟保護機制中發(fā)揮主要作用的是GSK-3β而不是GSK-3α。
miRNAs(microRNA)是一類內(nèi)
3、源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA,長約20~25個核苷酸。miRNAs通過堿基互補配對的方式結合靶messenger RNA(mRNA),降解或阻斷靶 mRNA的翻譯。多項研究表明,增加miR-199a-5p表達對改善心力衰竭和心房顫動等心臟疾病的病理生理改變有積極的促進作用。因此,靶向干預miR-199a-5p可能成為治療I/R損傷的有效靶點。
他汀類藥物可以預防心力衰竭、急性冠狀動脈綜合征(acute coronary s
4、yndrome,ACS),降低心血管病風險。本課題組前期實驗已證實,他汀類藥物預處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷,然而,他汀類藥物心臟保護作用的重要分子機制尚未完全闡明。因此我們推測,他汀類藥物可能通過miR-199a-5p/GSK-3β通路抑制細胞凋亡從而起到的心肌 I/R損傷的保護作用。
本研究通過建立心肌細胞氧糖剝奪再灌注損傷(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型模
5、擬心肌I/R損傷,檢測GSK-3βmRNA和蛋白表達水平的變化以驗證阿托伐他汀(atorvastatin,Ator)對H9c2心肌細胞和新生大鼠原代心肌細胞的作用。此外,我們首次發(fā)現(xiàn)了阿托伐他汀對miR-199a-5p表達的調(diào)控以及miR-199a-5p對GSK-3β基因表達的干預。于是我們進一步分析阿托伐他汀對心肌I/R損傷的作用機制,為心肌I/R損傷的預防和臨床治療提供了理論依據(jù)和新的干預靶點。
第一部分阿托伐他汀預處理對
6、大鼠原代心肌細胞氧糖剝奪再灌注損傷的保護作用及其機制研究
目的:探討阿托伐他汀預處理對大鼠原代心肌細胞氧糖剝奪再灌注損傷的保護作用,以及阿托伐他汀是否通過靶向GSK-3β發(fā)揮心肌保護的作用。
方法:
選擇出生1~3天的 SD大鼠,通過氧糖剝奪再灌注損傷模型模擬心肌缺血再灌注損傷,給予心肌細胞氧糖剝奪6 h,再灌注1h處理。
實驗分組:
1) control組:使用含10% FBS的DME
7、M高糖培養(yǎng)基,5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的原代心肌細胞。
2) OGD/R組:氧糖剝奪6 h,再灌注1h。
3) Ator+OGD/R組:在進行 OGD/R前,更換 Ator濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細胞3h,用PBS清洗細胞,然后進行氧糖剝奪再灌注。
4) LiCl+Ator+OGD/R組:使用LiCl濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細胞1h,用PBS清洗細胞,更換Ator濃度為1μM的
8、DMEM預處理細胞3h,用PBS清洗細胞,然后進行氧糖剝奪再灌注。
5) LiCl+OGD/R組:使用LiCl濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細胞1h,用PBS清洗細胞,然后進行氧糖剝奪再灌注。
心肌細胞缺血再灌注后,通過MTS檢測細胞活性,檢測乳酸脫氫酶(LDH)含量判斷細胞損傷情況,通過 Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達以及GSK-3β蛋白表達。利用實時定量PCR法檢測GSK-3β mRNA和m
9、iR-199a-5p表達。
結果:
1 Ator預處理對心肌細胞 GSK-3β蛋白和mRNA表達的影響。
Western blot法檢測GSK-3β蛋白表達,結果顯示,與 control組相比,OGD/R組心肌細胞GSK-3β蛋白表達水平明顯下降,兩者具有顯著性差異(P<0.05)。Ator預處理組GSK-3β蛋白表達水平較 OGD/R組顯著升高(P<0.05)。
應用實時定量PCR法,以β-ac
10、tin作為內(nèi)參進行相對定量。結果顯示,與 control組相比,OGD/R組心肌細胞GSK-3β mRNA表達水平明顯下降,兩者具有顯著性差異(P<0.05)。Ator預處理組GSK-3βmRNA表達水平較 OGD/R組顯著升高(P<0.05)。
2預處理Ator對原代心肌細胞活力的影響
通過 MTS測定心肌細胞活力,心肌細胞氧糖剝奪再灌注可導致明顯的心肌細胞活力下降。與 OGD/R組相比,Ator預處理組明顯增加了
11、心肌細胞活力(P<0.05)。加入GSK-3β抑制劑 LiCl和Ator共同預處理細胞組,LiCl取消了 Ator對心肌細胞的保護作用(P<0.05)。與 OGD/R組相比較,加入 LiCl后再進行氧糖剝奪再灌注對心肌細胞活力無明顯影響(P>0.05)。
3預處理Ator對原代心肌細胞 LDH的影響
檢測心肌細胞培養(yǎng)基中的LDH含量,與 control組相比,OGD/R組心肌細胞培養(yǎng)基中 LDH水平上升明顯,兩者具有
12、顯著性差異(P<0.05)。Ator預處理組LDH水平較 OGD/R組降低顯著(P<0.05)。加入LiCl和Ator共同預處理細胞組, LiCl取消了 Ator預處理降低LDH水平的作用(P<0.05)。與 OGD/R組相比較,單獨給予 LiCl對心肌細胞LDH釋放無明顯影響(P>0.05)
4 Ator預處理對原代心肌細胞凋亡相關蛋白Caspase9、B細胞淋巴因子-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、細
13、胞色素C(Cytochrome C,Cyto C)的影響。
Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白表達,與 control組相比, OGD/R組心肌細胞Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達明顯上升, Ator預處理組 Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達較 OGD/R組減少(P<0.05)。與Ator預處理組相比, LiCl+Ator組Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達升高(P<0.05
14、)。說明LiCl抵消了Ator預處理對心肌細胞OGD/R的保護作用。
5 Ator預處理對心肌細胞miR-199a-5p表達的影響。
miR-199a-5p在心肌細胞OGD/R損傷后以及Ator預處理后的損傷中表達變化明顯,為了研究miR-199a-5p在 Ator的心肌保護中的作用,應用實時定量PCR方法,以U6作為內(nèi)參進行相對定量。結果顯示,與 control組相比,OGD/R組心肌細胞miR-199a-5p表達
15、水平明顯上升,兩者具有顯著性差異(P<0.05)。Ator預處理組miR-199a-5p表達水平較 OGD/R組降低顯著(P<0.05)。
結論:
1 Ator預處理減輕心肌細胞氧糖剝奪再灌注損傷。
2 Ator預處理通過上調(diào)GSK-3β起到心肌細胞OGD/R損傷的保護作用。
3 miR-199a-5p在心肌細胞OGD/R后表達升高,而在Ator預處理的OGD/R后表達下降,可進一步研究miR-1
16、99a-5p在Ator預處理減輕心肌細胞OGD/R損傷中的作用。
第二部分阿托伐他汀預處理通過上調(diào)GSK-3β減輕H9C2心肌細胞缺血再灌注損傷
目的:探討阿托伐他汀預處理是否通過調(diào)節(jié)GSK-3β對H9C2心肌細胞氧糖剝奪再灌注損傷起到保護作用,以及 miR-199a-5p在 Ator預處理減輕H9C2細胞OGD/R損傷中的作用。
方法:
使用大鼠H9C2心肌細胞系傳代培養(yǎng),通過氧糖剝奪再灌注損傷
17、模型模擬心肌缺血再灌注損傷,經(jīng)歷氧糖剝奪6 h,再灌注1h處理。
實驗分組:
1) control組:使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基,5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的H9C2細胞。
2) OGD/R組:氧糖剝奪6 h,再灌注1h。
3) Ator+OGD/R組:在進行OGD/R前,更換Ator濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細胞3h,用PBS清洗細胞,然后進行OGD/R。
18、4) LiCl+Ator+OGD/R組:使用LiCl濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細胞1h,用PBS清洗細胞,更換Ator濃度為1μM的DMEM預處理細胞3h,用PBS清洗細胞,然后進行OGD/R。
5) LiCl+OGD/R組:使用LiCl濃度為1μM的DMEM高糖培養(yǎng)基孵育細胞1h,用PBS清洗細胞,然后進行OGD/R。
H9C2細胞缺血再灌注后,通過 MTS檢測細胞活性,檢測乳酸脫氫酶(LDH)含量判斷細
19、胞損傷情況,通過Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達以及GSK-3β蛋白表達。利用實時定量PCR法檢測GSK-3βmRNA和miR-199a-5p表達。
結果:
1 Ator預處理對H9C2細胞 GSK-3β蛋白和mRNA表達的影響。
通過Western blot法檢測GSK-3β蛋白表達,結果顯示,與 control組相比,OGD/R組H9C2細胞GSK-3β蛋白表達水平明顯下降,兩者具有顯著性
20、差異(P<0.05)。Ator預處理組GSK-3β蛋白表達水平較 OGD/R組顯著升高(P<0.05)。
應用實時定量PCR法,以β-actin作為內(nèi)參進行相對定量。結果顯示,與 control組相比,OGD/R組H9C2細胞GSK-3β mRNA表達水平明顯下降,兩者具有顯著性差異(P<0.05)。Ator預處理組GSK-3βmRNA表達水平較 OGD/R組顯著升高(P<0.05)。
2 Ator預處理對H9C2細
21、胞活力的影響
通過 MTS測定H9C2細胞活力,H9C2細胞OGD/R可導致細胞活力明顯下降。與 OGD/R組相比,Ator預處理組明顯增加了 H9C2細胞活力(P<0.05)。加入GSK-3β抑制劑 LiCl和Ator共同預處理細胞組, LiCl取消了Ator對H9C2細胞的保護作用(P<0.05)。與 OGD/R組相比較,加入 LiCl后再進行氧糖剝奪再灌注對H9C2細胞活力無明顯影響(P>0.05)。
3 At
22、or預處理對H9C2細胞 LDH的影響
檢測H9C2細胞培養(yǎng)基中的LDH含量,與 control組相比,OGD/R組H9C2細胞培養(yǎng)基中 LDH水平上升明顯,兩者具有顯著性差異(P<0.05)。Ator預處理組 LDH水平較 OGD/R組降低顯著(P<0.05)。加入GSK-3β抑制劑 LiCl和Ator共同預處理細胞組,LiCl取消了 Ator預處理降低 LDH水平的作用(P<0.05)。與 OGD/R組相比較,單獨給予 L
23、iCl對H9C2細胞LDH釋放無明顯影響(P>0.05)。
4 Ator預處理對H9C2細胞凋亡相關蛋白Caspase9、Bcl-2、Cyto C的影響。
Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白表達,與 control組相比,OGD/R組H9C2細胞Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達明顯上升(P<0.05), Ator預處理組Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達較 OGD/R組減少。與A
24、tor預處理組相比, LiCl+Ator組Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達升高(P<0.05)。說明LiCl抵消了Ator預處理對H9C2細胞OGD/R的保護作用。
5 Ator預處理對H9C2細胞miR-199a-5p表達的影響。
miR-199a-5p在H9C2細胞OGD/R損傷后表達增高,而在Ator預處理后的損傷中表達減少。為了研究miR-199a-5p在 Ator的心肌保護中的作用,應用實時定
25、量 PCR方法,以 U6作為內(nèi)參進行相對定量。結果顯示,與 control組相比,OGD/R組H9C2細胞miR-199a-5p表達水平明顯上升,兩者具有顯著性差異( P<0.05)。Ator預處理組miR-199a-5p表達水平較 OGD/R組降低顯著(P<0.05)。
結論:
1 Ator預處理減輕H9C2細胞氧糖剝奪再灌注損傷。
2 Ator預處理通過上調(diào)GSK-3β起到H9C2細胞OGD/R損傷的保
26、護作用。
3 OGD/R組miR-199a-5p高表達GSK-3β低表達,而在Ator預處理組 miR-199a-5p低表達 GSK-3β高表達,可進一步研究 miR-199a-5p對GSK-3β是否存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,以及 miR-199a-5p在 Ator預處理減輕H9C2細胞OGD/R損傷中的作用。
第三部分阿托伐他汀預處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用通過抑制miR-199a-5p
目的:探討 miR-
27、199a-5p與 GSK-3β之間的相互作用關系以及miR-199a-5p在Ator預處理減輕H9C2細胞OGD/R損傷中的作用。
方法:
采用大鼠 H9C2心肌細胞,使用20 nM濃度 miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染細胞24h。
實驗分組
1) control組:使用無 FBS無雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基,5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h的H9C2細胞。
2) OG
28、D/R組:氧糖剝奪6 h,再灌注1h。
3) miR-199a-5p inhibitor+ OGD/R組:在進行 OGD/R前,經(jīng)過miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染24h,然后進行氧糖剝奪再灌注。
4) miR-199a-5p inhibitor組:正常培養(yǎng)的細胞,經(jīng)過 miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染24h后,恢復正常培養(yǎng)。
使用RT-PCR法確認miRNA轉(zhuǎn)染效率,通過MTS
29、檢測細胞活性,檢測乳酸脫氫酶(LDH)含量判斷細胞損傷情況,通過Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達以及 GSK-3β蛋白表達。利用實時定量 PCR法檢測GSK-3β mRNA和 miR-199a-5p表達。采用免疫熒光技術檢測 GSK-3β蛋白表達。
結果:
1細胞轉(zhuǎn)染效率
通過RT-PCR法檢測miR-199a-5p的表達,以確定細胞轉(zhuǎn)染成功。相對于未轉(zhuǎn)染對照組和陰性轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染miR-199
30、a-5p mimic可導致H9C2細胞中miR-199a-5p的表達明顯上升,兩者具有顯著性差異(P<0.05),轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor可導致H9C2細胞中miR-199a-5p的表達明顯下降,兩者具有顯著性差異(P<0.05),說明細胞轉(zhuǎn)染成功。
2細胞轉(zhuǎn)染對基因表達的影響
2.1轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic和miR-199a-5p inhibitor對GSK-3β mRNA水平的
31、影響
相對于未轉(zhuǎn)染對照組和陰性轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic可導致H9C2細胞中GSK-3β mRNA的表達明顯下降,兩者具有顯著性差異(P<0.05),轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor可導致H9C2細胞中GSK-3βmRNA的表達明顯上升,兩者具有顯著性差異(P<0.05)。
2.2轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic和miR-199a-5p inhibitor對GSK-3β蛋白水平
32、的影響
轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic后H9C2細胞中GSK-3β蛋白表達水平較對照組明顯下降(P<0.05),轉(zhuǎn)染 miR-199a-5p inhibitor后 H9C2細胞中GSK-3β蛋白表達水平較對照組顯著上升(P<0.05)。提示miR-199a-5p對GSK-3β存在轉(zhuǎn)錄后的基因表達調(diào)控,抑制miR-199a-5p表達,可恢復GSK-3β活性。
3 miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染對
33、H9C2細胞活力的影響
通過 MTS測定H9C2細胞活力,將各組的結果與control組相比較,進行標準化處理。H9C2細胞氧糖剝奪再灌注可導致明顯的H9C2細胞活力下降。與OGD/R組相比,轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor后再進行OGD/R組,細胞活力明顯增加(P<0.05)。單純轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor細胞活性無明顯變化。
4 miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染對H
34、9C2細胞 LDH的影響
檢測H9C2細胞培養(yǎng)基中的LDH含量,將各組的結果與control組相比較,OGD/R處理后培養(yǎng)基中 LDH水平上升明顯,兩者具有顯著性差異(P<0.05)。與OGD/R組相比,轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor后再進行OGD/R組培養(yǎng)基中LDH水平明顯降低(P<0.05)。單純轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor對 LDH無明顯影響。
5 miR-199a-5p in
35、hibitor轉(zhuǎn)染對H9C2細胞凋亡相關蛋白Caspase9、Bcl-2和Cyto C的影響。
Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白表達,與 control組相比, OGD/R組H9C2細胞Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達明顯上升(P<0.05),轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor后再進行OGD/R組Caspase9、Bcl-2、Cyto C表達較 OGD/R組減少(P<0.05)。
36、 6 miR-199a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染對H9C2細胞 GSK-3β蛋白表達的影響。
實驗第二部分已證實,GSK-3β在心肌缺血再灌注損傷中起到至關重要的心肌保護作用,為了研究miR-199a-5p在OGD/R過程中如何靶向調(diào)節(jié)GSK-3β,我們通過Western blot法檢測GSK-3β蛋白表達,結果顯示,與 control組相比,OGD/R組H9C2細胞GSK-3β蛋白表達水平明顯下降,兩者具有顯著性差異(
37、P<0.05);轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor后再進行OGD/R組GSK-3β蛋白表達水平較 OGD/R組顯著升高(P<0.05);單純轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor使GSK-3β蛋白表達升高(P<0.05)。
免疫熒光法檢測結果顯示,與 control組相比,OGD/R組GSK-3β熒光明顯減弱;轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor后再進行OGD/R組GSK-3β熒光表達較 OGD/
38、R組增強;單純轉(zhuǎn)染miR-199a-5p inhibitor使GSK-3β熒光表達增強。
結論:
1 miR-199a-5p調(diào)控 GSK-3β轉(zhuǎn)錄后的基因表達, GSK-3β是miR-199a-5p的靶基因。
2抑制miR-199a-5p表達可以對抗H9C2細胞OGD/R損傷。
3抑制 miR-199a-5p通過上調(diào)靶基因 GSK-3β對抗 H9C2細胞OGD/R損傷。
4 Ator預處
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