pPolyHb對于心肌細胞缺血再灌注損傷的保護作用機制的初步研究.pdf

1、急性缺血性心血管疾病是指由血管內形成的血栓或栓塞引起急性器官循環(huán)障礙造成組織損害的一類疾病。臨床表現為急性缺血性心力衰竭、不同程度的心絞痛和心肌梗死等癥狀。發(fā)病率和死亡率僅次于癌癥，僅有少數急性病人可在發(fā)病3小時以內被確診并接受血管再通治療。95％以上的病人因其病程/病情發(fā)展，喪失了進行最佳的血管再通治療機會。另外隨時間的推移即使打開栓阻，由于血和氧的突然增加也會造成缺血再灌注損傷。因此，治療急性缺血性心腦血管疾病的核心是在最短的時間內

2、給被阻塞的組織和器官及時提供氧份以減少由于缺氧所造成的器官和組織壞死，保護缺氧的組織和器官，延長最佳治療時間;同時也要控制氧的供應量以避免溶栓時的再灌注所引起的氧、炎性因子和自由基等所引起的再灌注損傷。目前，臨床上主要采用針對時間窗內的溶栓和疏通梗阻的一些方法，如溶拴劑和支架介入治療，而缺乏在最短時間內對缺氧組織直接供氧的藥物。
　　血紅蛋白類氧載體(Hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs)是

3、在游離的去膜無基質血紅蛋白分子基礎上，添加交聯(lián)劑或者聚合劑，形成分子內交聯(lián)或者分子間聚合的一類具有類似于紅細胞攜氧釋氧以及擴容功能的的大分子聚合物。具有無需交叉配型、便于運輸、穩(wěn)定儲存、且不易受病毒微生物感染等一系列優(yōu)點，具有良好的開發(fā)應用前景。實驗室采用的戊二醛聚合豬血紅蛋白(polymerized porcine hemoglobin)，是在豬血紅蛋白分子基礎上添加戊二醛交聯(lián)劑合成的一種血紅蛋白類氧載體，因其遠遠小于紅細胞(7-8u

4、m)的分子直徑，僅為20nm左右，當血管發(fā)生病變形成栓塞時，其可通過血管腔內的狹窄間隙，及時為缺血區(qū)域的細胞和組織供氧。此外，pPolyHb含有heme基團，heme被報道可誘導血紅素加氧酶HO-1的合成，HO-1具有抗氧化應激與抗炎能力，此外，缺血/再灌時會產生大量的ROS導致線粒體功能障礙，進一步損傷細胞。因此，功能紊亂的線粒體必須得以及時清除以減少ROS的大量生成。研究發(fā)現，線粒體自噬能夠有效清除功能紊亂的線粒體以及過量產生的RO

5、S，確保細胞內線粒體功能正常穩(wěn)定。
　　本論文首先選擇大鼠H9C2心肌細胞系建立細胞缺氧復氧模型，根據MTT分別檢測pPolyHb對于正常細胞以及缺氧復氧細胞存活率的影響，檢測細胞上清液中的LDH和CK活性，選擇最適pPolyHb10uM和20uM兩個濃度組，建立缺血再灌注損傷模型;其次，探究pPolyHb對H9C2細胞缺血再灌注損傷的影響，主要檢測炎性因子TNF-α、IL-1β、抗炎性因子IL-10的表達，采用AnnexinⅤ-

6、FITC法檢測各組細胞凋亡率，western blot檢測凋亡蛋白Bax、Bcl-2和CytC以及HO-1的表達水平;最后為了揭示pPolyHb對H9C2細胞缺氧/復氧損傷中線粒體自噬的誘導分子機制，檢測線粒體自噬蛋白Parkin、Pink1表達的變化以及線粒體自噬抑制后細胞凋亡情況。
　　實驗結果顯示，pPolyHb能夠有效提高缺氧復氧后細胞生存活力，細胞毒性檢測指標LDH以及損傷指標CK活性相較于缺血再灌注損傷I/R組呈明顯降

7、低趨勢，并且pPolyHb能夠有效恢復缺氧/復氧后細胞生長形態(tài)。AnnexinⅤ-FITC法檢測各組細胞凋亡率結果顯示pPolyHb能夠改善細胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷，凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和CytC的表達水平顯示，pPolyHb復氧后能夠提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時降低促凋亡蛋白CytC和Bax的表達量，減輕心肌缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡，同時，pPolyHb可降低炎性因子TNF-α、IL-1β、以及升高IL-

8、10的表達發(fā)揮抗炎作用，并且能夠通過誘導HO-1的表達參與心肌細胞缺血再灌注損傷保護作用的調節(jié)。此外，線粒體自噬相關蛋白Pink1、Parkin表達結果顯示，pPolyHb復氧后，能夠有效誘導這兩種蛋白的表達，并隨著復氧時間的延長，蛋白表達量逐漸降低;采用線粒體分裂抑制劑抑制線粒體自噬后，結果顯示細胞抗凋亡相關蛋白Bcl-2含量下降，促凋亡蛋白Bax、CytC表達上升，證實pPolyHb復氧可能通過激活適度的線粒體自噬調節(jié)細胞凋亡，進而