pPolyHb對(duì)于心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、急性缺血性心血管疾病是指由血管內(nèi)形成的血栓或栓塞引起急性器官循環(huán)障礙造成組織損害的一類疾病。臨床表現(xiàn)為急性缺血性心力衰竭、不同程度的心絞痛和心肌梗死等癥狀。發(fā)病率和死亡率僅次于癌癥，僅有少數(shù)急性病人可在發(fā)病3小時(shí)以內(nèi)被確診并接受血管再通治療。95％以上的病人因其病程/病情發(fā)展，喪失了進(jìn)行最佳的血管再通治療機(jī)會(huì)。另外隨時(shí)間的推移即使打開栓阻，由于血和氧的突然增加也會(huì)造成缺血再灌注損傷。因此，治療急性缺血性心腦血管疾病的核心是在最短的時(shí)間內(nèi)

2、給被阻塞的組織和器官及時(shí)提供氧份以減少由于缺氧所造成的器官和組織壞死，保護(hù)缺氧的組織和器官，延長(zhǎng)最佳治療時(shí)間;同時(shí)也要控制氧的供應(yīng)量以避免溶栓時(shí)的再灌注所引起的氧、炎性因子和自由基等所引起的再灌注損傷。目前，臨床上主要采用針對(duì)時(shí)間窗內(nèi)的溶栓和疏通梗阻的一些方法，如溶拴劑和支架介入治療，而缺乏在最短時(shí)間內(nèi)對(duì)缺氧組織直接供氧的藥物。
　　血紅蛋白類氧載體(Hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs)是

3、在游離的去膜無(wú)基質(zhì)血紅蛋白分子基礎(chǔ)上，添加交聯(lián)劑或者聚合劑，形成分子內(nèi)交聯(lián)或者分子間聚合的一類具有類似于紅細(xì)胞攜氧釋氧以及擴(kuò)容功能的的大分子聚合物。具有無(wú)需交叉配型、便于運(yùn)輸、穩(wěn)定儲(chǔ)存、且不易受病毒微生物感染等一系列優(yōu)點(diǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)室采用的戊二醛聚合豬血紅蛋白(polymerized porcine hemoglobin)，是在豬血紅蛋白分子基礎(chǔ)上添加戊二醛交聯(lián)劑合成的一種血紅蛋白類氧載體，因其遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于紅細(xì)胞(7-8u

4、m)的分子直徑，僅為20nm左右，當(dāng)血管發(fā)生病變形成栓塞時(shí)，其可通過(guò)血管腔內(nèi)的狹窄間隙，及時(shí)為缺血區(qū)域的細(xì)胞和組織供氧。此外，pPolyHb含有heme基團(tuán)，heme被報(bào)道可誘導(dǎo)血紅素加氧酶HO-1的合成，HO-1具有抗氧化應(yīng)激與抗炎能力，此外，缺血/再灌時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的ROS導(dǎo)致線粒體功能障礙，進(jìn)一步損傷細(xì)胞。因此，功能紊亂的線粒體必須得以及時(shí)清除以減少ROS的大量生成。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬能夠有效清除功能紊亂的線粒體以及過(guò)量產(chǎn)生的RO

5、S，確保細(xì)胞內(nèi)線粒體功能正常穩(wěn)定。
　　本論文首先選擇大鼠H9C2心肌細(xì)胞系建立細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型，根據(jù)MTT分別檢測(cè)pPolyHb對(duì)于正常細(xì)胞以及缺氧復(fù)氧細(xì)胞存活率的影響，檢測(cè)細(xì)胞上清液中的LDH和CK活性，選擇最適pPolyHb10uM和20uM兩個(gè)濃度組，建立缺血再灌注損傷模型;其次，探究pPolyHb對(duì)H9C2細(xì)胞缺血再灌注損傷的影響，主要檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-1β、抗炎性因子IL-10的表達(dá)，采用AnnexinⅤ-

6、FITC法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，western blot檢測(cè)凋亡蛋白Bax、Bcl-2和CytC以及HO-1的表達(dá)水平;最后為了揭示pPolyHb對(duì)H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中線粒體自噬的誘導(dǎo)分子機(jī)制，檢測(cè)線粒體自噬蛋白Parkin、Pink1表達(dá)的變化以及線粒體自噬抑制后細(xì)胞凋亡情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pPolyHb能夠有效提高缺氧復(fù)氧后細(xì)胞生存活力，細(xì)胞毒性檢測(cè)指標(biāo)LDH以及損傷指標(biāo)CK活性相較于缺血再灌注損傷I/R組呈明顯降

7、低趨勢(shì)，并且pPolyHb能夠有效恢復(fù)缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)。AnnexinⅤ-FITC法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示pPolyHb能夠改善細(xì)胞凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷，凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和CytC的表達(dá)水平顯示，pPolyHb復(fù)氧后能夠提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)降低促凋亡蛋白CytC和Bax的表達(dá)量，減輕心肌缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡，同時(shí)，pPolyHb可降低炎性因子TNF-α、IL-1β、以及升高IL-

8、10的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用，并且能夠通過(guò)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)參與心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷保護(hù)作用的調(diào)節(jié)。此外，線粒體自噬相關(guān)蛋白Pink1、Parkin表達(dá)結(jié)果顯示，pPolyHb復(fù)氧后，能夠有效誘導(dǎo)這兩種蛋白的表達(dá)，并隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量逐漸降低;采用線粒體分裂抑制劑抑制線粒體自噬后，結(jié)果顯示細(xì)胞抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2含量下降，促凋亡蛋白Bax、CytC表達(dá)上升，證實(shí)pPolyHb復(fù)氧可能通過(guò)激活適度的線粒體自噬調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而