厄貝沙坦對糖尿病大鼠降壓以外的腎臟保護作用及其可能機制.pdf

1、目前對糖尿病腎病的發(fā)病機制尚未完全弄清楚。已經(jīng)證實，血糖升高是糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生的重要危險因素，然而有效的控制血糖并不能完全阻止糖尿病各種并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。近年的研究表明腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在糖尿病腎病的發(fā)病中具有重要作用。 ACE是Ang Ⅰ轉(zhuǎn)化為Ang Ⅱ最重要的酶，ACE在體內(nèi)表達廣泛。生理情況下，腎臟ACE主要表達于腎皮質(zhì)近端腎小管刷狀緣，腎小球內(nèi)皮細胞也有表達。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶-2 （ACE2）與ACE具

2、有42%的同源性；與ACE廣泛表達不同，ACE2主要高表達于心臟、腎臟和睪丸，提示其在心血管、腎臟及生育功能中發(fā)揮調(diào)控作用。生理情況下，ACE2在人腎臟中主要分布于近端腎小管刷狀緣，少量位于腎小球上皮細胞，小葉動脈內(nèi)皮和平滑肌細胞，以及中小靜脈內(nèi)皮細胞，但系膜細胞未發(fā)現(xiàn)ACE2表達。ACE2酶切Ang Ⅱ生成拮抗Ang Ⅱ的Ang（1-7），此外，ACE2還可以將Ang Ⅰ轉(zhuǎn)化為Ang（1-9）。由此可見，ACE和ACE2在維持腎內(nèi)An

3、g Ⅱ的平衡中具有重要作用。目前認為糖尿病早期，在尚未出現(xiàn)明顯的腎臟病變時，腎臟ACE表達降低，而ACE2的表達增加。這可能是機體的一種保護機制。當腎臟出現(xiàn)明顯病變時，腎臟ACE表達升高，而ACE2的表達降低。國內(nèi)有研究表明ARBs類藥物纈沙坦可以顯著升高糖尿病大鼠腎臟ACE2 mRNA和蛋白的表達。由此，本研究推測ARBs降壓以外的腎臟保護作用可能部分是通過下調(diào)ACE和上調(diào)ACE2的表達實現(xiàn)的。 鑒于此，本研究以分別以不同劑量

4、厄貝沙坦干預糖尿病大鼠8周，觀察尿微量白蛋白排泄率、肌酐清除率及腎臟病理改變；并以肼屈嗪作為降壓的陽性對照，探討厄貝沙坦降壓以外的腎臟保護作用及其劑量相關(guān)性。此外，觀察厄貝沙坦干預下糖尿病大鼠腎臟局部ACE和ACE2蛋白的表達及其劑量相關(guān)性，初步探討厄貝沙坦降壓以外的腎臟保護作用的可能機制。 第一章、厄貝沙坦對糖尿病大鼠降壓以外的腎臟保護作用及其劑量相關(guān)性。 目的： 1、觀察不同劑量厄貝沙坦對STZ誘導的糖尿病大

5、鼠尿微量白蛋白排泄率、肌酐清除率、腎臟病理的影響； 2、探討厄貝沙坦降壓以外的腎臟保護作用及其劑量相關(guān)性。 方法： 1、糖尿病大鼠模型的制備和分組：63只雄性Wistar大鼠（購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心），體重240～280g。按體重分層后隨機分為3組，分別為正常對照組（Ctrl組，n=7）、糖尿病對照組（DM組，n=14）和藥物干預組（n=42）。禁食過夜后，糖尿病對照組和藥物干預組大鼠56只一次性腹腔注射鏈

6、脲佐菌素（STZ，Sigma公司，美國）55mg/kg（溶于0.01mol/L枸櫞酸緩沖液，pH4.5），72小時后剪尾取血，以血糖儀（One touch ultra，強生公司，美國）測尾血全血血糖> 16.7mmol/L作為糖尿病模型。造模過程中，DM組死亡3只，藥物干預組死亡6只。藥物干預組糖尿病大鼠按體重再次隨機分為4組，于造模成功4周后分別給予25mg/kg·d厄貝沙坦（DM+Irb25組，n=9）、50mg/kg·d厄貝沙坦（

7、DM+Irb50組，n=9）、200mg/kg·d厄貝沙坦（DM+Irb200組，n=9）和30mg/kg·d肼屈嗪（DM+Hyd組，n=9）干預8周。造模后前4周，對血糖值≥30mmol/L的糖尿病大鼠予皮下注射長效胰島素來得時（Sanofi-anvitis公司，法國），2～4 IU/隔日，以避免酮癥的出現(xiàn)和保持大鼠生命活力。 2、厄貝沙坦（Sanofi-anvitis公司，法國）及肼屈嗪（Sigma，美國）用藥量根據(jù)大鼠體重

8、計算。溶于清潔飲水中灌胃給藥，每天一次。正常對照組和糖尿病對照組給予相應體積飲水灌胃。所有大鼠飼養(yǎng)于恒溫清潔環(huán)境（南方醫(yī)科大學實驗動物中心），自由進食及飲水。 3、給藥前及給藥8周后，采用Powerlab生物信息采集系統(tǒng)（Adinstrument，澳大利亞）測大鼠尾動脈收縮期血壓，待大鼠充分平靜后，連續(xù)測鼠尾動脈收縮期血壓血壓三次，取其平均值為該鼠收縮期血壓值。 4、標本的留?。航o藥8周后，大鼠放入代謝籠，留取24小時尿

9、液，計量尿量，尿液離心30分鐘（4℃，4000rpm），取上清分裝后于-70℃凍存，用于尿肌酐及尿微量白蛋白的檢測。大鼠麻醉后，經(jīng)腹主動脈插管取血4ml于促凝管，室溫下放置2小時后，離心15分鐘（4℃，3000rpm），留取血清待測血肌酐。4℃PBS灌注后取腎臟。迅速剝?nèi)ツI包膜，稱量腎重后縱向剖開腎臟，切取約0.5×0.5×0.2cm3大小的腎臟組織，置于10%中性福爾馬林緩沖溶液中固定24小時。 5、生化指標檢測：全自動生化分

10、析儀檢測血肌酐（Scr）和尿肌酐（Ucr）濃度。結(jié)合血、尿肌酐，計算內(nèi)生肌酐清除率（Ccr）。 Ccr（ml/min/kg）=（尿肌酐×24小時尿量）/（血肌酐×1440min×大鼠體重） 6、尿微量白蛋白排泄率的檢測：24小時尿微量白蛋白含量使用ELISA試劑盒（Rat albumin ELISA quatitation kit，Behtyl Laboratories，美國）檢測。 7、腎組織形態(tài)學觀察：10%

11、中性福爾馬林緩沖溶液固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋。2μm石蠟切片，過碘酸席夫氏染色（PAS）染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學變化。①每個腎小球橫截面積（Ag），每張切片隨機至少取20個腎小球，以Imagepro plus 5.1測其截面積，取其平均值。②腎小球體積（Vg），計算公式Vg=1.25×（Ag）3/2 8、統(tǒng)計方法。 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標準差（X±SD）表示。各組間計量資料的分析采

12、用One-way ANOVA，當P<0.05時用LSD法作多重比較。方差不齊性時，用Welch法校正，當P<0.05時用Games-Howell法作多重比較。干預前后計量資料的分析采用獨立樣本t檢驗。大鼠尾血全血血糖值的比較用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1、厄貝沙坦顯著降低糖尿病大鼠尿微量白蛋白、肌酐清除率，減輕腎臟肥大、腎小球肥大，延緩糖尿病大鼠腎臟病變的進展；在一定劑量范圍范

13、圍內(nèi)，厄貝沙坦的的腎臟保護作用呈劑量依賴性。 2、在降壓劣于肼屈嗪的情況下，厄貝沙坦降低尿微量白蛋白、肌酐清除率、腎臟肥大和腎小球肥大的作用顯著優(yōu)于肼屈嗪，說明厄貝沙坦還具有降壓以外的腎臟保護作用。其具體機制尚有待于進一步的研究。 第二章、厄貝沙坦對糖尿病大鼠腎臟局部RAS主要成分的影響。 目的： 觀察厄貝沙坦（Irbesartan）對STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟局部ACE和ACE2蛋白表達的影響及其劑量相

14、關(guān)性。探討厄貝沙坦對糖尿病大鼠腎臟保護作用的可能機制，為ARBs的臨床應用提供一定的動物實驗依據(jù)。 方法： 1、糖尿病大鼠模型的制備和分組。 同第一章。 2、厄貝沙坦、肼屈嗪灌胃給藥。 同第一章。 3、標本的留取 給藥8周后，大鼠麻醉，經(jīng)腹主動脈插管取血4ml于酶抑制劑抗凝管，小心上下輕輕顛倒幾次，混勻后即刻放入4℃冰箱中2小時，取出后離心7分鐘（4℃，2500rpm），留取血漿，分裝后

15、-70℃凍存。4℃PBS灌注后取腎臟，腎臟縱向剖開后，切取約0.5×0.5×0.2cm3大小的組織，置于10%中性甲醛緩沖溶液中固定。 4、血漿血管緊張素Ⅱ的檢測。 用血漿血管緊張素Ⅱ放射免疫試劑盒檢測（北京北方生物技術(shù)研究所）。嚴格按照試劑盒說明步驟進行。 5、免疫組化法檢測腎臟組織內(nèi)Ang Ⅱ、ACE和ACE2蛋白的表達。 10%中性甲醛固定液固定腎臟組織后，常規(guī)組織脫水、浸蠟、包埋、切片。兔抗大鼠A

16、ngⅡ多克隆抗體（1：200，武漢博士德公司）檢測腎組織AngⅡ的分布和表達；兔抗大鼠ACE多克隆抗體（1：100，Santa Cruz，美國）檢測腎組織ACE的分布和表達；兔抗大鼠ACE2多克隆抗體（1：100，Santa Cruz，美國）檢測腎組織ACE2的分布和表達。 6、統(tǒng)計方法。 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)士標準差（X±SD）表示。各組間計量資料的分析采用One-way ANOVA，當

17、P<0.05時用LSD法作多重比較。方差不齊性時，用Welch法校正，當P<0.05時用Games-Howell法作多重比較。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論： 1、糖尿病大鼠循環(huán)及腎臟局部Ang Ⅱ水平的變化不一致，顯示糖尿病時，循環(huán)RAS系統(tǒng)處于正常的狀態(tài)，而腎臟局部RAS系統(tǒng)則處以激活狀態(tài)，與既往研究結(jié)果一致。說明腎臟局部RAS系統(tǒng)的異常激活是導致糖尿病腎病的重要機制之一。 2、糖尿病大鼠腎臟局部