川芎嗪對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN），即糖尿病腎小球硬化，是糖尿?。―iabetes mellitus，，DM）嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的重要原因。DM病人一旦進(jìn)入臨床DN期（蛋白尿期），出現(xiàn)持續(xù)蛋白尿，病程不可逆，治療相當(dāng)困難，故強(qiáng)調(diào)預(yù)防。目前將DN的預(yù)防分為3級(jí)，其中一級(jí)預(yù)防是指正常白蛋白尿至微量白蛋白尿期的預(yù)防。DN的機(jī)制未明，近年來大量國(guó)內(nèi)外研究表明，多種因素參與了DN的發(fā)生、發(fā)展，細(xì)胞因子和

2、生長(zhǎng)因子合成增加所起到的作用越來越受到重視，已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在腎小球硬化及系膜基質(zhì)積聚中起關(guān)鍵作用，與DN發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。使用TGF-β1、VEGF單克隆抗體可顯著改善糖尿病大鼠腎小球硬化。 川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP

3、）化學(xué)名為四甲基吡嗪.是從川芎的生物堿中分離得到的有效單體，具有活血化瘀、抗血小板凝集、擴(kuò)張血管等多種作用，因其治療作用好、副作用少而廣泛用于心腦血管疾病的治療。其腎臟保護(hù)作用在一系列臨床與實(shí)驗(yàn)中已得到證實(shí)，但機(jī)制還不甚清楚。大量研究主要集中在川芎嗪對(duì)改善糖脂代謝，抑制血小板激活與聚集，改善血液流變等方面，尚少見到從生長(zhǎng)因子合成和分泌方面觀察是否對(duì)糖尿病大鼠腎臟有保護(hù)作用的報(bào)道。本課題旨在觀察活血化瘀藥川芎之主要成分川芎嗪（簡(jiǎn)稱TMP）

4、治療糖尿病腎病的療效，并探討其作用機(jī)制是否與影響生長(zhǎng)因子TGF-p1和VEGF有關(guān)。 目的： 觀察川芎嗪對(duì)糖尿病大鼠一般情況、血糖水平、腎功能、尿蛋白水平、腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響；觀察川芎嗪對(duì)糖尿病大鼠腎臟VEGF、TGF-β1表達(dá)的影響。探討川芎嗪治療糖尿病腎病的療效及作用機(jī)制。 方法： 1、動(dòng)物模型的制作選取雄性SPF級(jí)SD大鼠，體重180～220g，除正常對(duì)照組外，余大鼠均給予高脂高糖飲食（普通飼料：白

5、糖：豬油：雞蛋=14：3：2：1）6周后，禁食12h，采用1％STZ（臨用前用0.1mol/L、PH4.2枸櫞酸緩沖液配置，現(xiàn)配現(xiàn)用）按40mg/kg體重一次性腹腔注射。 2、模型納入標(biāo)準(zhǔn)注射STZ72小時(shí)后至少連續(xù)3d尾靜脈采血檢測(cè)血糖，隨機(jī)血糖≥16.65mmol/L者納入實(shí)驗(yàn)。 3、試驗(yàn)分組與用藥除正常對(duì)照組外，另將造模成功的大鼠隨機(jī)分為TMP80mg/（kg，d）組、160mg/（kg.d）組、25mg/（kg.

6、d）卡托普利組、模型對(duì)照組，每組6只，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)8周。 4、檢測(cè)指標(biāo)8周后結(jié)束治療，留取大鼠24小時(shí)尿液、采集血標(biāo)本、摘取腎臟稱重，觀察腎臟外形并拍照后處死大鼠。切取腎臟，HE及PAS染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)病理檢察。免疫組化法檢測(cè)各組大鼠腎組織VEGF及TGF-β1蛋白的表達(dá)。RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠腎組織VEGFmRNA及TGF-β1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： 1、TMP對(duì)各組糖尿病大鼠代謝指標(biāo)的影響動(dòng)物

7、造模8周后，測(cè)各組DM大鼠RBS、HbA1c值，各DM組均明顯高于正常組。TMP治療組與模型組比較，其血糖水平略有下降，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明川芎嗪降糖作用不明顯。DM模型組依其自然病程，在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，全部大鼠尿蛋白/肌酐（Upro/Ucr）比值均大于300mg/gcr，部分大鼠出現(xiàn)血肌酐升高，說明模型組大鼠已進(jìn)入DNIV或V期，即臨床蛋白尿期或尿毒癥，病程已不可逆。TMP各治療組與DM模型組比較，Upro/Ucr水平明顯較低，且

8、TMP160mg/kg組大鼠Upro/Ucr均低于或者輕度高于300mg/gcr，血肌酐尚在正常范圍內(nèi)，與DM模型組有顯著差異（p<0.05），屬DNⅢ期，說明使用TMP治療DM大鼠，能有效防治DN的發(fā)生和發(fā)展。 2、川芎嗪對(duì)大鼠腎臟組織顯微結(jié)構(gòu)的影響給藥8周后，腎臟組織HE及PAS染色光鏡下觀察顯示，正常對(duì)照組大鼠腎臟組織顯微結(jié)構(gòu)正常；DM模型組表現(xiàn)為腎小球肥大、毛細(xì)血管袢擴(kuò)張，伴系膜組織增殖，出現(xiàn)局灶節(jié)段性腎小球硬化，腎間質(zhì)

9、明顯局灶炎性分布及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管擴(kuò)張，基底膜明顯增厚。各治療組與模型組比較以上病理改變有不同程度的減輕。各DM組大鼠PAS陽性區(qū)域面積均明顯高于正常對(duì)照組，系膜區(qū)明顯增厚增寬，說明糖尿病模型對(duì)大鼠腎臟有明顯的病理損害。TMP160mg/kg組大鼠腎臟PAS陽性區(qū)域較模型組有明顯降低，提示給予TMP160mg/kg能抑制或者降低STZ所致DM大鼠的系膜增寬增厚，對(duì)DN大鼠腎臟有較好的保護(hù)作用。 3、TMP對(duì)大鼠腎臟TGF-β

10、1、VEGF表達(dá)的影響免疫組化圖像結(jié)果顯示：TGF-β1、VEGF陽性細(xì)胞胞漿染色為棕黃色。正常組腎臟組織僅檢出極少量TGF-β1、VEGF的表達(dá)，模型組TGF-β1、VEGF的表達(dá)顯著增加，陽性細(xì)胞數(shù)量多而密集，染色較深。各治療組腎皮質(zhì)TGF-β1、VEGF蛋白的表達(dá)也增高，但TMP160 mg/kg組與模型組比較，陽性細(xì)胞數(shù)較少而淺，IPP軟件分析其累計(jì)光密度值與模型組相比均顯著降低（P<0.05）。 4、TMP對(duì)大鼠腎臟T

11、GF-β1mRNA、VEGF mRNA表達(dá)的影響 RT-PCR結(jié)果顯示：正常組腎臟組織TGF-β1mRNA、VEGFmRNA表達(dá)極低，各DM組，腎臟組織TGF-β1mRNA、VEGFmRNA的表達(dá)均增高。TMP160 mg/kg劑量組與模型對(duì)照組比較，TGF-β1mRNA、VEGFmRNA的表達(dá)均顯著降低（P<0.05），與免疫組化的結(jié)果相符。 結(jié)論： 1、川芎嗪可抑制糖尿病腎病的發(fā)展，減少蛋白尿的排泄，改善糖