重鉻酸鉀對(duì)大鼠端粒長(zhǎng)度及端粒結(jié)合蛋白TRF1和TRF2表達(dá)的影響.pdf

1、鉻(Chromium,Cr)在自然界的主要存在形式是金屬鉻、六價(jià)鉻和三價(jià)鉻,其中六價(jià)鉻在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛。工人們接觸六價(jià)鉻的主要途徑是皮膚接觸和呼吸道吸入接觸,六價(jià)鉻對(duì)職業(yè)健康有著極大的危害,工人長(zhǎng)期接觸六價(jià)鉻可誘發(fā)肺癌。
　　 端粒(Telomere)是真核生物染色體末端的DNA-蛋白結(jié)構(gòu),它的長(zhǎng)度關(guān)系著細(xì)胞的衰老與死亡,并與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著緊密的關(guān)聯(lián)。
　　 端粒長(zhǎng)度是由端粒結(jié)合蛋白和端粒酶所共同調(diào)控的,端粒

2、酶通過與端粒末端結(jié)合來(lái)延伸端粒的長(zhǎng)度。端粒結(jié)合蛋白可以通過與端粒末端的特異性結(jié)合來(lái)改變端粒的結(jié)構(gòu),從而抑制端粒與端粒酶的結(jié)合,達(dá)到阻止端粒延長(zhǎng)的目的。
　　 目的:
　　 研究采用不同濃度的重鉻酸鉀溶液對(duì)大鼠進(jìn)行吸入染毒,分析六價(jià)鉻對(duì)大鼠端粒長(zhǎng)度及端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2表達(dá)的影響,為以后進(jìn)一步研究六價(jià)鉻致癌的機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.大鼠的急性吸入毒性試驗(yàn)選用健康成年SD大鼠40

3、只,體重180～220g。隨機(jī)分為4組,每組雌雄各半,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn),將染毒劑量設(shè)計(jì)為1000mg/m3、2150mg/m3、4640mg/m3和10000mg/m3,通過吸入染毒的方式對(duì)大鼠進(jìn)行處理。染毒后觀察14 d,記錄動(dòng)物的癥狀和死亡情況。對(duì)死亡動(dòng)物進(jìn)行大體解剖和病理學(xué)檢查。根據(jù)大鼠各組死亡情況,利用Horn氏法求出重鉻酸鉀對(duì)大鼠的LC50及其95％可信區(qū)間。
　　 2.大鼠的短期重復(fù)染毒毒性試驗(yàn)健康成年SD大鼠80只

4、,體重180～220g,隨機(jī)分為4組,每組20只。根據(jù)所得LC50,設(shè)計(jì)高、中、低3個(gè)劑量組,分別為1/10 LC50、1/31.6 LC50、1/100 LC50,用蒸餾水做空白對(duì)照。通過吸入染毒的方式連續(xù)染毒7 d,記錄染毒時(shí)動(dòng)物的癥狀和死亡情況。
　　 3.石墨爐原子吸收光譜法測(cè)大鼠血液中鉻的含量重復(fù)染毒毒性試驗(yàn)后,取各組大鼠血液,利用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定大鼠血液中鉻的含量。
　　 4.通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)大鼠

5、端粒長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)定重復(fù)染毒毒性試驗(yàn)后,取各劑量組大鼠右肺,從肺組織中提取出DNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析,根據(jù)Ct值計(jì)算出大鼠的相對(duì)端粒長(zhǎng)度。
　　 5.SP免疫組化法檢測(cè)大鼠TRF1、TRF2蛋白的表達(dá)重復(fù)染毒毒性試驗(yàn)后,取各劑量組大鼠左肺,固定包埋后,通過免疫組化法測(cè)其中TRF1、TRF2蛋白的表達(dá)。
　　 6.統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用SFSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用t檢驗(yàn)來(lái)分析不同濃度重鉻酸鉀對(duì)大鼠血鉻含量和端粒長(zhǎng)度的影

6、響;單因素方差分析來(lái)比較組間均值的差異,各組間兩兩比較時(shí)用Bonfferoni來(lái)校正;用Levene檢驗(yàn)來(lái)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn);采用Spearman秩相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.急性吸入毒性試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi),4640mg/m3劑量組,雌雄大鼠各死亡3只;10000 mg/m3劑量組,10只大鼠全部死亡,其余各組無(wú)死亡。由此查Horn氏表,可得重鉻酸鉀對(duì)大鼠的L

7、C50為4300 mg/m3,根據(jù)LC50設(shè)計(jì)短期重復(fù)染毒毒性試驗(yàn)的染毒劑量分別是430mg/m3、136mg/m3和43 mg/m3。
　　 2.短期重復(fù)染毒毒性試驗(yàn)中,中劑量組死亡2只大鼠,高劑量組死亡4只大鼠。
　　 3.高、中、低劑量組和對(duì)照組中大鼠血鉻的含量分別為:2534.11±150.98mg/L、796.40±126.55mg/L、97.12±6.88mg/L、14.98±2.39mg/L,多組間比較差異

8、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.63,P＜0.05)。
　　 4.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果:高、中、低劑量組和對(duì)照組中大鼠端粒相對(duì)長(zhǎng)度分別為0.20±0.04、0.39±0.05、0.61±0.06、1.13±0.11,多組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=664.041,P＜0.05)。高、中、低劑量組和對(duì)照組的端粒長(zhǎng)度與血鉻含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.78、-0.56、-0.52、-0.45,均P＜0.05)。
　　 5.免疫組化結(jié)果:

9、高、中、低劑量組和對(duì)照組TRF1蛋白的平均光密度值依次是:0.36±0.03、0.32±0.02、0.29±0.01、0.28±0.02,組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=125.20,P＜0.05),TRF2蛋白的平均光密度值依次是:0.25±0.01、0.23±0.03、0.20±0.04、0.19±0.01,組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=64.71,P＜0.05)。其中,高、低劑量組和對(duì)照組TRF1與TRF2蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)