BMSC在微泡及BiAb輔助下修復(fù)心肌纖維化的實(shí)驗(yàn)研究及PⅢNP對(duì)冠心病合并代謝綜合征患者的預(yù)測(cè)價(jià)值.pdf

1、病理性心肌纖維化是心血管疾病中的一個(gè)重要研究課題[2]。近年來,干細(xì)胞移植在缺血性心臟病的治療領(lǐng)域顯示出獨(dú)特的魅力。盡管在藥物干預(yù)、介入治療和外科手術(shù)方面取得了可喜的進(jìn)展,使心肌纖維化的癥狀改善,閉塞的血管再通,但是心肌細(xì)胞缺乏增殖能力,對(duì)于已經(jīng)梗死的心肌細(xì)胞和纖維化的心肌尚無辦法使其恢復(fù)并發(fā)揮正常的舒縮功能。20世紀(jì)90年代以來,隨著干細(xì)胞生物工程的蓬勃開展[3],具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的干細(xì)胞給心血管疾病的治療帶來了新的突破

2、性的進(jìn)展。
　　 在細(xì)胞心肌成形術(shù)中,常用的干細(xì)胞有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymfl stem cell,BMSC)、造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞等。BMSC取材方便、數(shù)量豐富、免疫排斥性低、不存在倫理爭(zhēng)議[4]、能分化為心肌細(xì)[5],這些優(yōu)點(diǎn)使BMSC成為細(xì)胞心肌成形術(shù)治療中的較優(yōu)選擇[6]。
　　 干細(xì)胞移植修復(fù)損傷心肌具有廣闊的臨床應(yīng)用前景,但一些亟待解決的瓶頸問

3、題制約著細(xì)胞心肌成形術(shù)的發(fā)展應(yīng)用。隨著研究不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)移植入的干細(xì)胞有效歸巢到受損靶位的數(shù)量極少[7,8]。這直接影響了干細(xì)胞的修復(fù)效果。此外,干細(xì)胞修復(fù)心肌纖維化的病理生理機(jī)制尚不完全清楚。
　　 經(jīng)靜脈移植BMSC安全性高、易操作,但靶向性差、效率低。因此找尋一種既能從靜脈移植,又能提高移植效率的方法極為重要。同時(shí),這種方法若能增加BMSC的歸巢率、優(yōu)化歸巢微環(huán)境,將使纖維化心肌的修復(fù)效果事半功倍。
　　 近年

4、來研究發(fā)現(xiàn),超聲微泡不僅是一種可以用于增強(qiáng)超聲組織灰階顯像的造影劑,而且可作為一種新型的藥物或基因運(yùn)載工具。將特定的藥物或基因與微泡結(jié)合在一起,通過外周血管注射,經(jīng)體外超聲定位輻照破壞與之結(jié)合的微泡,可使藥物或基因在特定組織內(nèi)定位釋放,微泡破裂后引起機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)可使靶組織內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮間隙增寬或破裂,基因或藥物可進(jìn)入特定的組織內(nèi)[8]。前期研究顯示超聲微泡可促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子成功轉(zhuǎn)移至大鼠缺血心肌,促進(jìn)血管新生,微血管密度有明顯的

5、增加[9]。亦有研究證實(shí),超聲破壞微泡可增加局部血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜粘附分子的表達(dá),從而促進(jìn)骨髓單個(gè)核細(xì)胞粘附于內(nèi)皮上,基于這些理論基礎(chǔ),超聲破壞微泡技術(shù)是否可以作為一種新型的促進(jìn)干細(xì)胞定向移植的有效方法有待進(jìn)一步進(jìn)行探討。
　　 CD29抗體是BMSC表面高表達(dá)的分子標(biāo)志;抗肌凝蛋白輕鏈抗體(anti-myosin light chain antibody,AMLCA)是損傷心肌特異性抗體。AMLCA能與心室肌特異性地結(jié)合,而與肝

6、、脾、腎等非肌性組織以及骨骼肌、血管和腸平滑肌無交叉反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn),急性心肌損傷發(fā)生后AMLCA可通過破裂的肌細(xì)胞膜與壞死心肌結(jié)合,而不是與細(xì)胞膜完整的正常心肌細(xì)胞結(jié)[9]。本課題首先構(gòu)建CD29×AMLCA這一雙特異性抗體(bispecific antibody,BiAb),然后將BiAb和超聲輻照微泡作為增效措施,輔助BMSC移植入心肌纖維化小鼠,檢測(cè)BMSC歸巢率的變化,同時(shí)探討B(tài)MSC修復(fù)心肌纖維化的可能機(jī)制。
　　

7、除了對(duì)BMSC在增效措施下干預(yù)心肌纖維化的效果和機(jī)制進(jìn)行探討外,本課題還開展了心肌纖維化血漿標(biāo)志物PⅢNP預(yù)測(cè)冠心病合并代謝綜合征患者近期心臟重塑及預(yù)后的探索性研究。在冠心病人群中,許多患者同時(shí)合并代謝綜合征,如何客觀衡量并預(yù)測(cè)這類患者的心血管重塑程度,并判斷其預(yù)后,具有重要臨床價(jià)值。間質(zhì)膠原代謝失衡是心血管重塑的重要形態(tài)基礎(chǔ),血漿膠原標(biāo)志物PⅢNP與慢性心衰、急性心梗相關(guān)。冠心病合并代謝綜合征患者罹患慢性心衰的風(fēng)險(xiǎn)較大,這類人群的心血

8、管重塑引起心功能惡化、動(dòng)脈順應(yīng)性下降,活動(dòng)耐力降低。血漿膠原標(biāo)志物PⅢNP在冠心病合并代謝綜合征患者中意義如何,與動(dòng)脈粥樣硬化疾病及其危險(xiǎn)因素的相關(guān)性尚不完全清楚。此部分研究用血漿膠原標(biāo)志物PⅢNP判斷冠心病合并代謝綜合征患者的近期心血管重塑程度,并預(yù)測(cè)其發(fā)展趨勢(shì),探尋心肌纖維化血漿標(biāo)志物對(duì)預(yù)后的判斷價(jià)值。
　　 綜上,本課題主要包括以下五部分內(nèi)容:
　　 第一部分心肌纖維化模型制備及其膠原沉積機(jī)制
　　 目的:

9、建立理想的心肌纖維化小鼠模型并探討其膠原沉積機(jī)制。方法:將BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組10只。實(shí)驗(yàn)組予以腹部皮下注射異丙腎上腺素50mg/kg,每天2次,連續(xù)10天。對(duì)照組同法注射生理鹽水。45天后處死小鼠,天狼猩紅染色觀察心臟Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維含量,熒光定量PCR檢測(cè)心臟基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9,MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissueinhibitor o

10、f metalloproteinase-1,TIMP-1)基因表達(dá),免疫組化染色分析心、肝、腎組織層粘連蛋白(laminin,LN)的表達(dá)。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組小鼠心臟膠原沉積較多,MMP-9、TIMP-1、LN表達(dá)上調(diào)(p＜0.05),肝、腎組織LN無明顯改變(p＞0.05)。結(jié)論:異丙腎上腺素能制備理想的心肌纖維化小鼠模型,其機(jī)制與心臟MMP-TIMP失衡有關(guān)。
　　 第二部分小鼠骨髓間充質(zhì)千細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　 目

11、的:建立一種分離、培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)的穩(wěn)定方法,并通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型、功能學(xué)指標(biāo)進(jìn)行鑒定。方法:無菌分離小鼠股骨,以全骨髓貼壁法培養(yǎng)BMSC。穩(wěn)定傳代后,以光鏡形態(tài)學(xué)觀察,CD29、CD44、CD117流式細(xì)胞術(shù),成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)鑒定BMSC。結(jié)果:全骨髓貼壁培養(yǎng)法能獲得穩(wěn)定的BMSC,呈平行排列或漩渦狀生長(zhǎng)。細(xì)胞呈梭形或多角型,CD29、CD44、CD117陽性表達(dá)率分別為99.94％、99.28%、1.35%,

12、誘導(dǎo)成骨、成脂分化成功。結(jié)論:全骨髓貼壁法能從小鼠骨髓中分離培養(yǎng)出均質(zhì)性良好的BMSC。
　　 第三部分超聲微泡及雙特異性抗體增效骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢及干預(yù)心肌纖維化
　　 目的:探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)在BiAb和超聲輻射微泡(microbubble,MB)的輔助下歸巢并干預(yù)心肌纖維化的效果。方法:以CD29抗體(能識(shí)別間充質(zhì)干細(xì)胞)和抗肌凝蛋白輕鏈抗體(AMLCA)(能特異性結(jié)合損傷心肌)制備BiAb(CD2

13、9×AMLCA)。將此BiAb與雄性小鼠BMSC輸入異丙腎性心肌纖維化雌性小鼠,輔以超聲輻照微泡(BMSC+BiAb+MB組)。另設(shè)單純BMSC組、單純BiAb組、單純MB組、BiAb+BMSC治療組、正常對(duì)照組、未治療組。5周后處死小鼠,熒光定量PCR檢測(cè)心肌Y染色體鑒別基因(sex-determining region ofY-Chromosome,SRY)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-

14、1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)的表達(dá)。天狼猩紅染色觀察膠原分布,western-blot觀測(cè)心臟信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1(signal transducer and activators oftranscription-1,STATl)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducerand activators of transcription-3,S

15、TAT3)的表達(dá)。結(jié)果: BMSC歸巢數(shù)最多的是BMSC+BiAb+MB組,其次為BMSC+BiAb組,BMSC組歸巢數(shù)最少。與未治療組相比,BMSC+BiAb+MB組、BMSC+BiAb組和單純BMCS組的心肌MMP-9、TIMP-1和STAT1表達(dá)下調(diào),STAT3表達(dá)升高,膠原沉積降低(p＜0.05)。其中,與單純BMSC組相比,BMSC+BiAb+MB組的心肌STAT3表達(dá)明顯上調(diào),TIMP-1明顯下調(diào)(p＜0.05)。結(jié)論:CD

16、29×AMLCA雙特異抗體可促進(jìn)小鼠BMSC的歸巢,聯(lián)合超聲輻射微泡,可進(jìn)一步增加干細(xì)胞的歸巢率和修復(fù)效果。BMSC歸巢后能改善缺血心肌MMP-TIMP表達(dá),干預(yù)心肌纖維化,其機(jī)制可能與心肌STAT介導(dǎo)的信號(hào)通路有關(guān)。
　　 第四部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)心肌纖維化的可能機(jī)制
　　 目的:探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)移植干預(yù)心肌纖維化的可能機(jī)制。方法:分離培養(yǎng)雄性小鼠BMSC,經(jīng)尾靜脈輸入異丙腎性心肌纖維化雌性小鼠(治

17、療組)。另設(shè)未治療組和正常對(duì)照組。5周后處死小鼠,免疫組織化學(xué)染色法觀察心臟核轉(zhuǎn)錄因子-κb(nuclear factor-κb,NF-κb)、核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和細(xì)胞凋亡蛋白酶(caspase-3)的表達(dá),熒光定量PCR檢測(cè)心肌SRY、MMP-9、TIMP-1的表達(dá),天狼猩紅染色觀察膠原分布。結(jié)果:與未治療組相比,治療組心肌有雄性BMSC歸巢,膠原沉積減少,NF

18、-κb、caspase-3表達(dá)下調(diào),PCNA表達(dá)增加(p＜0.05)。結(jié)論: BMSC移植到纖維化心肌,能抑制NF-κb過度活化,改善心肌增殖-凋亡狀態(tài)。其干預(yù)機(jī)制與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)有關(guān)。
　　 第五部分 PⅢNP預(yù)測(cè)冠心病合并代謝綜合征患者近期心臟重塑程度及預(yù)后
　　 目的:探討血漿Ⅲ型前膠原氨基末端肽(PⅢNP)對(duì)冠心病合并代謝綜合征患者心血管重塑及預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法:連續(xù)入選108例冠心病合并代謝綜合征患者(平均

19、年齡63.29±3.32歲,女性56%),放免法測(cè)定PⅢNP水平,檢測(cè)并隨訪1年后患者心臟、頸動(dòng)脈彩超、6分鐘步行距離(6MWT)。根據(jù)PⅢNP的中位數(shù)水平(3.5μg/L)將受試者分為高低水平兩組,統(tǒng)計(jì)其各指標(biāo)差異,多元逐步回歸分析影響PⅢNP的因素,并分析PⅢNP與心血管重塑程度的相關(guān)性,COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析心腦血管事件再入院的預(yù)測(cè)因子,ROC曲線分析PⅢNP判斷再住院的閾值。結(jié)果:血漿PⅢNP水平與冠心病合并代謝綜合征患者年齡(

20、β=0.686,p＜0.001),高敏C反應(yīng)蛋白(β=0.194,p=0.001),BMI(β=0.108,p=0.023)相關(guān)。與PⅢNP＜3.5μg/L組相比,PⅢNP≥3.5μg/L組患者的心律不齊發(fā)生率、1年內(nèi)再住院率和左心室心肌重量指數(shù)(LVMI)明顯增加,6MWT縮短(p均＜0.05)。隨著Ln PⅢNP(r=0.271,p=0.007)升高,隨訪期間心臟重塑程度加重。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型顯示,PⅢNP、INEF、高敏C反應(yīng)蛋