代謝綜合征心肌纖維化發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)的研究.pdf

1、背景: 過去的二十年里，全球代謝綜合征(MS)的患病率逐年遞增，糖尿病及肥胖人數(shù)也隨之增加。隨著MS帶來的心血管病發(fā)病率的上升，我們認(rèn)識(shí)到防治這一全球性疾病迫在眉睫。MS是包括糖耐量異常、胰島素抵抗、腹型肥胖、血脂異常及高血壓等心血管疾病危險(xiǎn)因素的一組癥候群。胰島素抵抗被認(rèn)為是該綜合征的核心的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。而炎癥可能在MS中起重要作用。 臨床研究證實(shí)MS患者有不同程度的左室舒張功能障礙，表現(xiàn)為心肌松弛性減低和僵硬度增大

2、。心肌纖維化是左室舒張功能障礙發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，但在MS中的發(fā)生機(jī)制尚不明確。研究表明炎癥是除腎素-血管緊張素-醛固酮(RASS)系統(tǒng)和高血壓之外致心肌纖維化的重要因素，許多炎癥因子參與了心肌纖維化的形成和發(fā)展。而MS是一種慢性炎癥狀態(tài)，血中炎癥因子高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、白介素-6(IL-6)、白介素-18(IL-18)等都有升高。IL-18作為IL-1家族成員之一，可以通過激活JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與一些反應(yīng)。INK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

3、通路是將信息從細(xì)胞表面?zhèn)鞯郊?xì)胞核內(nèi)的一系列絲氨酸/蘇氨酸酶，主要對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育起介導(dǎo)作用。位于JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的核因子AP-1包含c-jun/c-fos蛋白，JNK通過激活A(yù)P-1使存在AP-1結(jié)合位點(diǎn)的基因表達(dá)增強(qiáng)。與心肌纖維化有關(guān)的基因，例如Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9基因，都存在AP-1的結(jié)合位點(diǎn)。因此我們推斷IL-18可以通過激活JNK/AP-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路加重心肌纖維化參與MS的發(fā)生

4、發(fā)展，這在國內(nèi)外均未見研究報(bào)道。本研究在綜合分析心肌纖維化研究動(dòng)態(tài)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基礎(chǔ)上，提出“IL-18/JNK/AP-1”信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MS心肌纖維化發(fā)病中可能起重要作用的假說，利用轉(zhuǎn)染IL-18腺病毒載體技術(shù)，深入研究IL-18在MS心肌纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用。 目的: (1)建立果糖喂養(yǎng)Wistar大鼠MS的動(dòng)物模型； (2)觀察MS大鼠模型心肌組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化，明確心肌纖維化存在及分布特點(diǎn)

5、； (3)明確“IL-18/JNK/AP-1”信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各關(guān)鍵分子在MS大鼠心肌組織的表達(dá)： (4)構(gòu)建IL-18腺病毒載體并轉(zhuǎn)染MS大鼠，驗(yàn)證“IL-18/JNK/AP-1”信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在MS心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的作用； (5)采用超聲心動(dòng)圖技術(shù)和心導(dǎo)管技術(shù)全面評(píng)價(jià)MS大鼠模型以及轉(zhuǎn)染IL-18腺病毒載體后MS大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能的變化。 方法: 雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為兩組：正常對(duì)照

6、組(n=12只)，MS組(n=38只)。正常對(duì)照組以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，并給予普通飲水；MS組大鼠以標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，并給予10％高果糖飲水。高果糖喂養(yǎng)32周后，將MS組大鼠隨機(jī)分為三組：MS組(n=9只)，繼續(xù)給予高果糖飲水；空載體組(n=9只)，繼續(xù)給予高果糖飲水的同時(shí)通過尾靜脈注射1×1010PFU含GFP腺病毒載體；IL-18載體組(n=13只)，繼續(xù)給予高果糖飲水的同時(shí)通過尾靜脈注射1×1010PFU IL-18腺病毒載體：正常

7、對(duì)照組及MS組給予等體積的生理鹽水尾靜脈注射。轉(zhuǎn)染腺病毒載體6周后，處死動(dòng)物，取大鼠心肌組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中，進(jìn)行以下檢測(cè)：(1)各組大鼠每?jī)芍軠y(cè)量體重及尾動(dòng)脈血壓一次；(2)分別于實(shí)驗(yàn)前，高果糖喂養(yǎng)32周后，轉(zhuǎn)染載體后1周、2周、3周、4周、6周抽取各組大鼠頸靜脈竇血2ml檢測(cè)空腹血糖、空腹胰島素、甘油三酯、總膽固醇、血中IL-18濃度，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA)；(3)分別于實(shí)驗(yàn)前、高果糖喂養(yǎng)32周后、實(shí)驗(yàn)?zāi)┻M(jìn)行超聲心動(dòng)圖

8、檢查：(4)于實(shí)驗(yàn)?zāi)┯涗浉鹘M大鼠心電圖，以心導(dǎo)管法進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定；(5)心肌組織超微結(jié)構(gòu)和病理學(xué)檢查；(6)應(yīng)用Masson染色觀察心肌纖維化程度；(7)免疫組織化學(xué)檢測(cè)IL-18、I型膠原、III型膠原的蛋白表達(dá)；(8)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)IL-18、I型膠原、III型膠原的mRNA表達(dá)；(9)Western-blot檢測(cè)JNK和磷酸化JNK蛋白的表達(dá)；(10)凝膠電泳遷移分析檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性。 結(jié)果:1 體

9、重、尾動(dòng)脈收縮壓及生化指標(biāo)高果糖喂養(yǎng)32周后，與正常對(duì)照組相比，MS組大鼠體重增加(P＜0.01)，尾動(dòng)脈收縮壓升高(P＜0.001)；血清甘油三酯(P＜0.01)及空腹胰島素(P＜0.001)升高，HOMA增加(P＜0.001)，而總膽固醇及空腹血糖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 轉(zhuǎn)染IL-18腺病毒載體后6周，與MS組和空載體組比較，IL-18載體組血胰島素水平(P＜0.001)及HOMA(.P＜0.05)升高；而體重、尾動(dòng)脈收縮壓、甘油三

10、酯、總膽固醇在IL-18載體組與MS組和空載體組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2.血清IL-18水平變化轉(zhuǎn)染前MS組大鼠血IL-18水平較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.001)。IL-18腺病毒轉(zhuǎn)染后1周，IL-18載體組大鼠血清IL-18水平較空載體組顯著升高(P＜0.001)，轉(zhuǎn)染后2周達(dá)到最高水平，約為空載體組血清IL-18水平的4倍(P＜0.001)，于轉(zhuǎn)染后3周開始降低，但仍高于空載體組IL-18水平(P＜0.001)，4 周時(shí)與空

11、載體組IL-18水平相當(dāng)。 3.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)正常對(duì)照組12只大鼠，均未見二尖瓣或三尖瓣返流。MS組9只大鼠，輕度二尖瓣返流2只，中度二尖瓣返流1只，重度二尖瓣返流0只；輕度三尖瓣返流2只，中度三尖瓣返流0只，重度三尖瓣返流1只；其中2只二尖瓣、三尖瓣均存在返流；二尖瓣、三尖瓣均無返流5只。空載體組9只大鼠，輕度二尖瓣返流1只，中度二尖瓣返流2只，重度二尖瓣返流1只；輕度三尖瓣返流1只，中度三尖瓣返流0只，重度三尖瓣返流1只；其

12、中2只二尖瓣、三尖瓣均存在返流；二尖瓣、三尖瓣均無返流5只。IL-18載體組13只大鼠，輕度二尖瓣返流3只，中度二尖瓣返流2只，重度二尖瓣返流1只：輕度三尖瓣返流2只，中度三尖瓣返流1只，重度三尖瓣返流1只；其中3只二尖瓣、三尖瓣均存在返流；二尖瓣、三尖瓣均無返流6只。正常對(duì)照組大鼠無瓣膜返流發(fā)生，MS組及空載體組大鼠瓣膜返流發(fā)生率均為44.44％，IL-18載體組大鼠瓣膜返流發(fā)生率為53.85％。Fisher檢驗(yàn)顯示：與對(duì)照組相比，M

13、S組大鼠瓣膜返流發(fā)生率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與空載體組相比，IL-18載體組大鼠瓣膜返流發(fā)生率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05). 與正常對(duì)照組相比，MS組大鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)明顯擴(kuò)大(P＜0.01)，舒張末期室間隔(IVSd)、左室后壁同步增厚(LVPWd)(P＜0.05)，左房?jī)?nèi)徑(LA)明顯擴(kuò)大(P＜0.001).與正常對(duì)照組相比，MS組大鼠E峰、Ea峰明顯降低(P＜0.001)，等容舒張時(shí)間(I

14、VRT)延長(zhǎng)(P＜0.01)，Tei指數(shù)增加(P＜0.001)，左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、短軸縮短率(FS)、相對(duì)室壁厚度(RWth.)及E/Ea峰比值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與MS組和空載體組相比，IL-18載體組大鼠LVDd、IVSd、LVPWd、LA及RWth均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與MS組和空載體組相比，IL-18載體組大鼠E峰、Ea峰降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：IVRT(P＜0.01)；Tei指數(shù)增加(.P＜0.01)；EF、FS及E/Ea峰比

15、值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4 心電圖變化正常對(duì)照組12只大鼠心電圖均基本正常。MS組和空載體組各9只大鼠中6只心電圖出現(xiàn)QRS波正負(fù)交替變化為特征的心電圖改變，1只大鼠出現(xiàn)復(fù)雜心律失常(兩種以上的心電圖異?；?qū)挻蠡蔚腝RS波)，2只大鼠心電圖基本正常。 結(jié)論: (1)給予Wistar大鼠10％的高果糖飲水32周后，大鼠出現(xiàn)尾動(dòng)脈收縮壓升高，體重增加，血液中甘油三酯、胰島素水平升高，反應(yīng)胰島素抵抗的指標(biāo)HOMA增加，提示

16、成功建立了符合人類MS特點(diǎn)的大鼠模型： (2)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)顯示，MS大鼠心臟E峰、Ea均降低，IVRT延長(zhǎng)，Tei指數(shù)增加，心導(dǎo)管檢查顯示LVSP、LVEDP升高，-dp/dt、-do/dt/LVSP下降，T延長(zhǎng)，提示MS大鼠存在心臟舒張功能減低； (3)Masson染色證實(shí)心肌間質(zhì)及血管周圍膠原含量增加，免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)定量RT-PCR證實(shí)Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白和mRNA表達(dá)水平升高，提示MS大鼠存在心肌纖維化

17、，這可能是MS心臟舒張功能的障礙的主要病理學(xué)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)； (4)MS大鼠血液中IL-18濃度升高，免疫組織化學(xué)染色和實(shí)時(shí)定量RT-PCR證實(shí)心肌組織中炎癥因子IL-18蛋白和mRNA表達(dá)水平升高，且與心肌膠原含量及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白和mRNA表達(dá)水平呈顯著相關(guān)關(guān)系，提示IL-18可能是MS心肌纖維化的重要機(jī)制之一。MS大鼠心肌組織磷酸化JNK水平升高，轉(zhuǎn)錄因子AP-1活性增強(qiáng)，提示在MS大鼠模型中，IL-18可能通過“JNK