KLF15對(duì)心肌纖維化調(diào)控作用的研究.pdf

1、目的:
　　心臟瓣膜疾病在成人心臟疾病中占很大比重，是造成心力衰竭的主要病因之一。慢性主動(dòng)脈瓣狹窄是臨床常見(jiàn)的導(dǎo)致左心室超負(fù)荷的疾病，通過(guò)主動(dòng)脈瓣膜置換解除流出道梗阻是典型的卸負(fù)荷過(guò)程。理論上瓣膜置換術(shù)后左心室壓力負(fù)荷解除，臨床癥狀應(yīng)改善徹底，但部分患者心功能仍不能有效恢復(fù)，癥狀緩解不明顯，甚或有加重趨勢(shì)，并不能使患者受益。具體原因尚不明確，是否與心肌纖維化程度有關(guān)？
　　壓力超負(fù)荷/卸負(fù)荷后心肌重塑決定心功能的恢復(fù)。心肌重

2、塑是指在各種機(jī)械應(yīng)力、代謝和遺傳的因素作用下產(chǎn)生的以包括心肌細(xì)胞肥大、間質(zhì)纖維化、細(xì)胞間基質(zhì)成分增加和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變等為特征的病理生理過(guò)程。早期心肌肥厚是壓力超負(fù)荷作用下產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，它主要發(fā)生在長(zhǎng)期壓力超負(fù)荷的情況下，心肌總量增加，收縮力增強(qiáng)，是一種有效的代償方式。然而，這種代償能力是有限的，當(dāng)肥大心肌的需氧量得不到滿(mǎn)足時(shí)，心肌間質(zhì)纖維化加重，最終導(dǎo)致心肌收縮功能障礙。
　　在真核生物中，KLFs家族是基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(BTE

3、BP)中的一大類(lèi)，它們參與早期的胚胎生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、組織器官的形成、原癌基因的突變和血管生成等生理病理過(guò)程，是真核生物中最大、最重要的一類(lèi)基礎(chǔ)調(diào)控因子，這些KLF因子在生物體多種細(xì)胞類(lèi)型中廣泛表達(dá)，發(fā)揮著各自不同的重要作用。既往針對(duì)此家族的眾多因子有過(guò)廣泛的研究，例如對(duì)KLF5基因敲除大鼠的研究顯示該因子在連續(xù)注射血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥厚、纖維化反應(yīng)過(guò)程中是必不可少的;而且，在體外培養(yǎng)的心肌成纖維細(xì)胞中，KLF5基因直接調(diào)控了與組

4、織重塑和傷口愈合有關(guān)的血小板起源的生長(zhǎng)因子PDGF-A的轉(zhuǎn)錄;另外，在心肌成纖維細(xì)胞中特異性敲除KLF5基因，減輕了中等強(qiáng)度壓力超負(fù)荷所致心肌肥厚，是心血管重塑中的一個(gè)重要調(diào)控因子，在壓力超負(fù)荷心肌纖維化中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。而KLF15是已發(fā)現(xiàn)的17個(gè)KLFs家族基礎(chǔ)調(diào)控因子中的重要一員，它在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等各個(gè)環(huán)節(jié)中起重要作用。
　　綜合以上研究及發(fā)現(xiàn)，我們認(rèn)為心肌重塑導(dǎo)致的超微結(jié)構(gòu)改變是影響心臟功能恢復(fù)的主要分子生物學(xué)事

5、件，KLF15又是其中重要的關(guān)鍵因子。本課題擬建立有效的動(dòng)物及細(xì)胞模型，在此動(dòng)物和細(xì)胞兩個(gè)水平上探尋KLF15在心肌肥厚、纖維化中的具體調(diào)控機(jī)制。
　　方法:
　　本課題基于上述問(wèn)題，采用在體、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行，主要分為以下四個(gè)部分:
　　第一部分:采用野生型雄性SD大鼠，鼠齡3-4周，在非人工通氣的條件下，于主動(dòng)脈瓣上、升主動(dòng)脈處縮窄，建立了壓力超負(fù)荷心肌肥厚、纖維化動(dòng)物模型，并在不同時(shí)間段解除縮窄制作卸

6、壓力負(fù)荷模型;使用心臟彩色多普勒對(duì)該動(dòng)物模型相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以明確造模效果。
　　第二部分:利用大鼠非人工通氣升主動(dòng)脈縮窄-松解模型，探尋不同時(shí)間點(diǎn)超負(fù)荷及完全卸壓力負(fù)荷后心肌病理改變和心肌纖維化轉(zhuǎn)歸特征，探討KLF15基因在此過(guò)程中的作用，及其與TGF-β、CTGF、MRTF-A間的相互關(guān)系，了解KLF15基因在壓力超負(fù)荷所致心肌纖維化的可能機(jī)制。
　　第三部分:進(jìn)行了大鼠心肌成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)的原代細(xì)胞做出了

7、鑒定以及細(xì)胞增殖、凋亡情況的觀察，并在此基礎(chǔ)之上建立了TGF-β促體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞肥大模型，為心肌肥厚、纖維化發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸的進(jìn)一步具體分子機(jī)制研究提供細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　第四部分:在體外培養(yǎng)大鼠心肌成纖維細(xì)胞基礎(chǔ)之上，以所構(gòu)建的TGF-β促細(xì)胞肥大模型為平臺(tái)，引入干涉和過(guò)表達(dá)KLF15腺病毒載體并轉(zhuǎn)染，從細(xì)胞水平上探討了心肌纖維化及轉(zhuǎn)歸中的具體分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、我們利用SD大鼠在非人工通氣

8、的條件下完成了升主動(dòng)脈的縮窄及松解手術(shù)，通過(guò)心臟彩色多普勒檢測(cè)，從彩超圖像及相關(guān)測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)果中了解到:縮窄效果確切，縮窄后升主動(dòng)脈直徑縮小約50％，橫截面積縮小約75％，縮窄遠(yuǎn)端有較明顯擴(kuò)張，縮窄后左室后壁、室間隔厚度增加明顯，而心臟射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率、左室收縮壓明顯降低，左室舒張末壓明顯增加，而縮窄松解后，升主動(dòng)脈直徑、心臟射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短率、左室收縮壓均有所恢復(fù)，室壁及室間隔厚度、左室舒張末壓均有不同程度降低。
　

9、　2、在大鼠非人工通氣升主動(dòng)脈縮窄及松解動(dòng)物模型中，主動(dòng)脈瓣上縮窄后1周，即開(kāi)始出現(xiàn)左心室肥厚、心肌纖維化，隨縮窄時(shí)間延長(zhǎng)，肥厚纖維化增加，TGF-β、CTGF、MRTF-A等細(xì)胞因子的mRNA及蛋白表達(dá)水平逐漸增加，而KLF15因子的mRNA及蛋白表達(dá)水平卻逐漸減少;升主動(dòng)脈縮窄后松解，心臟的各項(xiàng)指標(biāo)（包括心室肥厚情況、心肌纖維化程度等）都有所改善，但早期(1W)、中期(3W)、晚期(6W)縮窄后松解組的恢復(fù)程度有一定差異，越早去縮窄

10、的，各指標(biāo)改善更為顯著。這說(shuō)明心臟結(jié)構(gòu)、功能的恢復(fù)程度與縮窄的持續(xù)時(shí)間有關(guān)。而TGF-β、CTGF、MRTF-A等細(xì)胞因子的mRNA及蛋白表達(dá)水平松解后有逐漸減少趨勢(shì)，KLF15因子的變化則相反，越早去縮窄越能更好的恢復(fù)并接近正常。
　　3、通過(guò)對(duì)所培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光鑒定、增殖及凋亡等生物活性檢測(cè)，我們可知該大鼠心肌成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法可靠，操作簡(jiǎn)便，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，純度高，可穩(wěn)定傳代;通過(guò)對(duì)Ⅰ型膠原m

11、RNA水平的檢測(cè)結(jié)果分析，TGF-β確有促心肌成纖維細(xì)胞肥大、纖維化的作用，且效果明顯。
　　4、所構(gòu)建的KLF15過(guò)表達(dá)腺病毒及其干擾片段在體外培養(yǎng)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞中有較高的轉(zhuǎn)染率，轉(zhuǎn)染效率與作用濃度和時(shí)間在一定范圍內(nèi)也呈正相關(guān)。過(guò)表達(dá)KLF15腺病毒與心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，KLF15 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著提高，TGF-β、CTGF、MRTF-A的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，其細(xì)胞肥大、纖維化減輕，Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維

12、含量減少。而KLF15干擾片段與細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，上述各指標(biāo)變化均與之相反。
　　結(jié)論:
　　1、成功建立大鼠非人工通氣升主動(dòng)脈縮窄/松解模型，該模型操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，經(jīng)濟(jì)，為今后進(jìn)行心肌壓力超負(fù)荷-卸負(fù)荷研究提供了良好的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái);
　　2、在大鼠心肌成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了TGF-β促細(xì)胞肥大模型，為心肌肥厚、纖維化發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)歸的進(jìn)一步具體分子機(jī)制研究提供了良好的技術(shù)手段和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)平臺(tái);
　

13、　3、KLF15可通過(guò)反饋調(diào)節(jié)TGF-β，抑制CTGF及MRTF-A的作用，減輕心肌間質(zhì)纖維化及心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，從而改善心功能，在促心肌肥厚、纖維化中起關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控因子作用。
　　4、KLF15對(duì)心肌纖維化作用的可能機(jī)制為:在壓力超負(fù)荷刺激時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力或化學(xué)因素的作用下，TGF-β表達(dá)增加，通過(guò)自（旁）分泌的形式作用于成纖維細(xì)胞，活化P38MAPK進(jìn)而抑制KLF15的表達(dá)，一方面，低表達(dá)的KLF15失去對(duì)