阿司匹林在心肌纖維化中的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　近年來(lái)，缺血性心血管疾病致死率居高不下，并且其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。典型的缺血性心血管疾病包括心肌梗死(myocardial infarction，AMI)、冠心病、心絞痛以及心力衰竭等。然而，目前該類(lèi)疾病的治療與預(yù)防仍缺乏有效的臨床藥物。因此，缺血性心血管發(fā)病機(jī)理以及相關(guān)治療藥物的研發(fā)是目前該領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的問(wèn)題。
　　心臟纖維化是最常見(jiàn)的由缺血性心血管疾病引發(fā)的病理學(xué)特征。心肌梗死、心律失常、急性心肌

2、缺血、心力衰竭，以及炎癥和老化均會(huì)導(dǎo)致心臟纖維化。心臟纖維化能夠?qū)е滦呐K傳導(dǎo)功能異常、舒張和收縮功能受損，誘發(fā)心臟功能?chē)?yán)重紊亂。但是，纖維化的病理學(xué)發(fā)生過(guò)程還未明確;并且目前用于治療心臟纖維化的藥物不僅療效低、生效慢而且副作用較強(qiáng)。因此，心臟纖維化的發(fā)病機(jī)理以及相關(guān)治療藥物均有待于進(jìn)一步的探索。
　　心臟成纖維細(xì)胞(Cardiac Fibroblasts，CFs)是哺乳動(dòng)物心臟中除了心肌細(xì)胞外分布最豐富的細(xì)胞類(lèi)型，大約占心臟內(nèi)總細(xì)

3、胞數(shù)的三分之二。傳統(tǒng)觀點(diǎn)普遍認(rèn)為CFs的主要功能是分泌膠原蛋白形成細(xì)胞外基質(zhì)從而維持心臟結(jié)構(gòu);但最近研究表明，心肌缺血后損失的心肌細(xì)胞無(wú)法通過(guò)細(xì)胞分裂補(bǔ)充，而是由CFs增殖、遷移分化為成肌纖維細(xì)胞，分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs)，增加膠原蛋白的分泌等活動(dòng)來(lái)修補(bǔ)缺失的心肌細(xì)胞，即心臟纖維化過(guò)程。另外，許多研究者認(rèn)為CFs在心肌梗死后的炎癥反應(yīng)、傷口愈合以及心室重構(gòu)等一系列病理?xiàng)l件下的心臟

4、生理功能中發(fā)揮著重要的作用。所以，研究心臟纖維化的發(fā)病機(jī)理的關(guān)鍵在于研究缺血性心臟病發(fā)生以及病后心臟CFs的增殖、分化以及凋亡等一系列生物學(xué)過(guò)程。并且，探索現(xiàn)有藥物以及小分子化合物對(duì)CFs的影響將會(huì)為相關(guān)疾病藥物的研發(fā)提供一定的理論依據(jù)。
　　阿司匹林，也稱(chēng)為乙酰水楊酸(aspirin，ASA)，是廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療以及預(yù)防的藥物。阿司匹林可以有效地防止發(fā)生血凝塊高風(fēng)險(xiǎn)患者的心臟病發(fā)作、中風(fēng)和血凝塊形成。據(jù)報(bào)道，ASA抑制

5、血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)激活的CFs生長(zhǎng)，膠原合成和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的生成。ASA還抑制細(xì)胞因子IL(interleukin)-18誘導(dǎo)的CFs遷移，表明ASA可能發(fā)揮著潛在的抗心臟纖維化作用，但ASA在體內(nèi)心臟纖維化中具體的功能和分子機(jī)制基礎(chǔ)機(jī)制仍不清楚。
　　自噬是進(jìn)化上高度保守的生理學(xué)過(guò)程，其主要功能是在胞內(nèi)形成雙層膜泡從而包裹長(zhǎng)壽蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器運(yùn)

6、往溶酶體降解。越來(lái)越多的證據(jù)表明自噬在維持心臟纖維化的心臟功能中起著至關(guān)重要的作用。ASA已被報(bào)道通過(guò)其抗血小板和抗炎功能來(lái)緩解心臟病。ASA對(duì)自噬的作用表現(xiàn)為細(xì)胞特異性;ASA通過(guò)激活PI3K/Akt-GSK3-mTOR通路抑制上皮自噬，而通過(guò)抑制mTOR信號(hào)誘導(dǎo)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞自噬。那么，在心臟CFs中，ASA對(duì)自噬作用如何，以及通過(guò)何種信號(hào)通路目前還未明了。
　　ROS是調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的一個(gè)重要因素。作為抗氧化劑，ASA可廣泛的

7、減少ROS的產(chǎn)生。因此，ROS可能是介導(dǎo)ASA發(fā)揮作用的一個(gè)關(guān)鍵因子。此外，有研究證明心肌纖維化發(fā)病機(jī)理涉及ROS依賴(lài)的炎癥細(xì)胞因子和MMPs的高表達(dá)，以及CFs的激活和遷移。同時(shí)，許多研究表明ROS-p38信號(hào)軸在心肌纖維化中發(fā)揮重要的作用。絲裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)是MAPK（ERK，JNK，p38激酶）家族中重要成員之一，其在ASA的功能發(fā)揮過(guò)程（如抗炎，抗腫瘤）中起到關(guān)鍵的作用。有報(bào)道指出p38的激活參與各種器官

8、纖維化過(guò)程:抑制p38可緩解腎臟纖維化，而激活p38則促進(jìn)肝臟纖維化。此外，研究表明氧化應(yīng)激可通過(guò)p38途徑參與自噬的激活。據(jù)此，我們提出假設(shè):ASA可能通過(guò)ROS-p38途徑影響CFs的自噬從而干預(yù)心臟纖維化過(guò)程。
　　研究目的：
　　1.明確ASA對(duì)心臟纖維化的治療作用。
　　2.探討ASA對(duì)CFs細(xì)胞自噬活性的影響。
　　3.基于ROS、p38途徑確定ASA對(duì)CFs細(xì)胞自噬的作用機(jī)制。
　　研究方法：

9、
　　1.采用異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)注射建立小鼠體內(nèi)心臟纖維化模型。10周齡Bal10周齡b/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組6只:對(duì)照，ISO，ISO+ ASA以及ISO+卡托普利。對(duì)照組給予生理鹽水皮下注射。卡托普利為陽(yáng)性對(duì)照。采用皮下注射ISO誘導(dǎo)心肌纖維化，劑量為前3天3 mg/kg/d，后18天6 mg/kg/d。給予ASA(10 mg/kg/d)灌胃處理。在ISO處理14天后，采用超聲心動(dòng)圖初步評(píng)估

10、心肌纖維化是否成功。灌胃21天后，2％異氟烷深度麻醉小鼠，脫頸處死。
　　2.采用結(jié)扎左前降支建立小鼠心肌梗死(MI)模型。10周齡C57bl/6雄鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組，MI，MI+ASA。MI組永久性結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。假手術(shù)在冠狀動(dòng)脈左前降支下穿線不結(jié)扎。ASA在結(jié)扎后第二天給予ASA(10mg/kg/d)灌胃處理，連續(xù)14天。
　　3.從新生1到3天的SD大鼠心臟分離CFs，置入缺氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)(95％ N2，5％

11、 CO2)構(gòu)建心肌纖維化體外模型。ASA處理組則加入不同濃度的ASA(0.5，2.5，5 mM)處理12小時(shí)。CFs在ASA加入之前進(jìn)行自噬抑制劑胃蛋白酶抑制劑(PepstatinA，PepA)，自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin)，P38MAPK(P38)抑制劑SB203580或ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acety1-cysteine，NAC)預(yù)處理1小時(shí)探討ASA與自噬的關(guān)系，以及ROS/p38參與的機(jī)制。
　　4

12、.實(shí)驗(yàn)?zāi)z測(cè):
　　(1)采用超聲心動(dòng)圖分析心臟功能，計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricularej ection fraction，EF)，左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，F(xiàn)S）以及左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPW)的變化。
　　(2)對(duì)心肌組織進(jìn)行Masson三色、苦味酸天狼猩

13、紅染色，定量分析心肌組織膠原沉積，評(píng)價(jià)心肌纖維化程度。
　　(3)采用乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)細(xì)胞毒性檢測(cè)，磺酰羅丹明B（sulfonyl rhodamine B，SRB）染色以及5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EdU)標(biāo)記評(píng)估CFs細(xì)胞增殖和活性。
　　(4)TUNEL染色和caspase3活性分析評(píng)估CFs細(xì)胞的凋亡情況。
　　(5)2，7-雙乙酸二氯熒光素(DCFH-DA)熒光

14、探針標(biāo)記法來(lái)測(cè)定ROS。
　　(6)免疫印跡檢測(cè)增殖(AKT)，凋亡（caspase3和Parp1）和自噬（LC3-Ⅱ）蛋白的表達(dá)。
　　所有數(shù)據(jù)均按照均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表達(dá)。用方差分析和Tukey post-hoe或t檢驗(yàn)分析方法進(jìn)行組間比較。P值＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.所有的動(dòng)物都完成實(shí)驗(yàn)，未見(jiàn)死亡。超聲心動(dòng)圖結(jié)果表明ISO注射或MI構(gòu)建都可顯著導(dǎo)致小鼠EF，F(xiàn)S以及LVPW降低(P＜

15、0.05)。Masson三色和苦味酸天狼猩紅染色表明心肌損傷時(shí)，纖維化程度嚴(yán)重，表現(xiàn)較高的總膠原蛋白沉積。而ASA處理可逆轉(zhuǎn)上述改變，減輕心臟損傷，阻滯心肌纖維化，顯著降低心肌組織中總膠原蛋白的百分比。
　　2.LDH細(xì)胞毒性，SRB染色，EdU標(biāo)記以及AKT磷酸化水平降低共同證明了ASA可通過(guò)抑制CFs增殖發(fā)揮其抗纖維化作用，且此過(guò)程成濃度依賴(lài)性(P＜0.05)。凋亡標(biāo)記物，包括切割活化的caspase3和Parp1，也被ASA

16、抑制，因此凋亡抑制是ASA抑制心臟纖維化時(shí)產(chǎn)生的副作用，此推測(cè)進(jìn)一步通過(guò)TUNEL和caspase3活性分析得到確認(rèn)。
　　3.此外，研究還發(fā)現(xiàn)ASA能顯著降低LC3-Ⅱ的表達(dá)(P＜0.05)，提示其自噬抑制功能。當(dāng)ASA聯(lián)合使用自噬抑制劑PepA可降低LC3-Ⅱ的表達(dá)(P＜0.05)。與ASA一樣，PepA能降低AKT磷酸化，提高ASA的功能，提示ASA可能通過(guò)抑制自噬發(fā)揮抗纖維化的作用。更重要的是，PepA不影響凋亡，Parp

17、1表達(dá)未見(jiàn)變化。隨后，我們采用自噬激活劑雷帕霉素聯(lián)合處理CFs細(xì)胞，結(jié)果表明雷帕霉素可明顯提高CFs細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，進(jìn)一步確認(rèn)了ASA對(duì)CFs細(xì)胞增殖的抑制作用呈自噬依賴(lài)性。此外，結(jié)果表明ASA降低p38和Erk的磷酸化，但對(duì)JNK的磷酸化沒(méi)有影響。p38抑制劑SB203580單獨(dú)，或者聯(lián)合ASA使用都可增加LC3-Ⅱ表達(dá)水平(P＜0.05)，提示p38可以調(diào)節(jié)自噬。同時(shí)，SB203580促進(jìn)ASA誘導(dǎo)的AKT磷酸化的降低，

18、說(shuō)明p38信號(hào)通路可能在ASA抗纖維化過(guò)程發(fā)揮重要的作用。與PepA一樣，SB203580對(duì)細(xì)胞凋亡同樣沒(méi)有影響，Parp1表達(dá)未見(jiàn)變化。我們的研究同樣發(fā)現(xiàn)ASA可抑制CFs細(xì)胞產(chǎn)生ROS。與ASA和SB203580聯(lián)合作用相似，ROS清除劑NAC可上調(diào)LC3-Ⅱ表達(dá)和抑制AKT的磷酸化(P＜0.05)。因此我們推測(cè)ROS也通過(guò)調(diào)節(jié)自噬參與ASA的抗纖維化作用。NAC也能抑制裂解caspase3的表達(dá)，提示ASA抑制凋亡呈自噬獨(dú)立，RO

19、S依賴(lài)的方式。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)ISO皮下注射和結(jié)扎左前降支，我們成功建立了心肌纖維化模型，為心肌纖維化發(fā)病機(jī)制的研究提供了可靠的平臺(tái)。
　　2.ASA處理可顯著改善心肌纖維化程度，為開(kāi)展ASA臨床治療提供依據(jù)。
　　3.ASA通過(guò)自噬和p38/ROS依賴(lài)的信號(hào)通路發(fā)揮抗CFs增殖功能，從而緩解心肌纖維化的發(fā)展。PepA和SB203580不影響ASA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡抑制。因此，聯(lián)合使用PepA和SB2035