人血清免疫球蛋白類定時散射比濁檢測系統(tǒng)的研制.pdf

1、人體內(nèi)存在著10萬種以上的蛋白質(zhì)，在機體中承擔著不同的任務，來源于組織細胞，對維持人體機能變化起著重要的作用，當疾病狀態(tài)時又起著重要病理意義的那些特殊蛋白，統(tǒng)稱為特定蛋白。為了揭示生命活動的規(guī)律，識別和檢測這些蛋白質(zhì)以及生理功能是必然的發(fā)展方向。人體免疫系統(tǒng)中也存在著這樣一類與免疫系統(tǒng)疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及預后緊密關聯(lián)的特定蛋白，包括免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、以及補體C3、C4。人體免疫系統(tǒng)

2、是人類保持健康、避免發(fā)生各種疾病的自衛(wèi)防御系統(tǒng)，它是人類在進化過程里，與自然環(huán)境作斗爭中逐漸建立和完善的，是一個組織嚴密、分工精細，成員眾起各種疾病時，具有抵抗力，確保人體內(nèi)環(huán)境的統(tǒng)一、穩(wěn)定和平衡。人體內(nèi)免疫功能失調(diào)會引起惡性腫瘤、慢性腎病、慢性肝炎、慢性胃病、糖尿病、紅斑狼瘡、風濕性心臟病、硬化癥、重癥肌無力、類風濕、中老年性疾病等各種免疫系統(tǒng)疾病，嚴重威脅著人類的健康，隨著社會的發(fā)展和醫(yī)學科技的不斷進步，越來越多的免疫系統(tǒng)疾病被人們

3、所重視，與其密切相關的特定蛋白的檢測也日益受到廣大醫(yī)學和科研工作者的青睞及關注。目前國內(nèi)外常用的特定蛋白的檢測方法包括單向免疫擴散法、免疫電泳法、酶聯(lián)免疫測定(ELISA)、化學發(fā)光免疫測定(CLIA)、時間分辨免疫測定(TRFIA)、透射比濁法等，但是這些方法都存在一定的弊端，操作繁瑣，費時，不易自動化，因此檢測時不僅將增加被檢測者的經(jīng)濟負擔，也使檢測者耗費更多時間、精力和試劑。
　　 隨著實驗技術的發(fā)展，特種蛋白分析技術由最

4、初的試管沉淀反應、瓊脂凝膠的擴散試驗，發(fā)展到現(xiàn)代免疫分析技術，特種蛋白免疫分析技術方法逐步完善，其靈敏度逐步提高，檢測水平由微克(μ g)發(fā)展到納克(ng)，甚至皮克(pg)水平。特種蛋白分析儀是近年來國內(nèi)常購的用于檢測特種蛋白的臨床檢驗設備。特定蛋白分析儀是利用抗原-抗體在一定條件下反應形成免疫復合物的原理，用免疫濁度法檢測懸浮于緩沖液中的抗原-抗體免疫復合物顆粒的定量測定方法。特種蛋白分析儀從結構上主要分為透射比濁和散射比濁。

5、>　　 免疫比濁測定法(Immunoturbidimetry)具備生化檢測的快速性和免疫分析的特異性，是將現(xiàn)代光學測量儀器與自動化檢測系統(tǒng)相結合應用于沉淀反應的方法，可對各種液體介質(zhì)中的微量抗原、抗體和藥物以及小分子半抗原物質(zhì)進行定量測定。與其它免疫分析方法相比，免疫比濁技術除了具有操作簡單、靈活、檢測范圍廣，易于自動化等顯著特點，其最突出優(yōu)勢還在于克服了抗原過量引起的高劑量HOOK效應。最早可追溯到1967年，Ritchie等報道了

6、散射比濁法(Nephelometry)，其原理是光線通過檢測溶液時，被其中所含的抗原抗體復合物折射而部分發(fā)生偏轉(zhuǎn)，產(chǎn)生散射光。根據(jù)雷利散射公式，在一定條件下，透射光與微粒濃度成反比，散射光與微粒濃度成正比。散射比濁法可分為終點和速率散射比濁法及動態(tài)定時散射比濁法。而散射免疫比濁測定法，具有線性范圍寬廣，測定速度快，精密度高，特異性強、重復性好，結果穩(wěn)定可靠，并可批量測定等優(yōu)點，是一種微量、快速、自動化檢測體液中特定蛋白質(zhì)成分的免疫化學分

7、析技術。
　　 近年來，國內(nèi)隨著臨床檢測需求的增加，免疫比濁測定方法的應用也越來越普遍，因此對相應試劑及緩沖液的的使用也呈廣泛趨勢，但是由于國內(nèi)臨床使用的儀器基本依賴于進口，這就引發(fā)了一個嚴重的問題，這些儀器大多都只能使用它們自己的原裝試劑和緩沖液，而且大都價格昂貴，不適宜大批量長期使用，使其在臨床使用局限化。如果能研制出與儀器配套的試劑及緩沖液，將為臨床檢驗解決一個重大難題。目前國內(nèi)也有公司進行這方面的研究，但是都不盡人意，只

8、是停留在起步階段。這就決定了開發(fā)配套國產(chǎn)試劑及其相關緩沖液具有巨大的市場前景，填補了國產(chǎn)試劑的空缺，可以推動國內(nèi)臨床檢驗技術的發(fā)展進步。鑒于臨床上對特定蛋白檢測的必要性以及目前檢測手段的局限性，我們的研究目的是研制出能應用于散射免疫比濁技術的國產(chǎn)相關檢測試劑和緩沖液，滿足國內(nèi)市場的需求，并為廣大臨床患者帶去福音。
　　 本實驗室采用的是動態(tài)定時散射比濁法(Fixed-Time Nephelometric AssayFTNA)，該

9、方法的原理：由于免疫沉淀反應是在抗原抗體相遇后立即開始，在極短時間內(nèi)反應介質(zhì)中散射信號變動很大，此時計算峰值信號會產(chǎn)生一定誤差。故在抗原抗體反應時留出預反應時間，即散射光信號第一次讀數(shù)在開始反應7.5s～2min內(nèi)，大多數(shù)情況下2min以后測第二次讀數(shù)，并從第二次讀數(shù)中扣除第一次讀數(shù)，最后轉(zhuǎn)換為待測抗原濃度。抗原、抗體劑量.反應曲線是由Heidelberger首次發(fā)現(xiàn)，在抗體過量階段，沉淀物的量隨著抗原濃度成比例增加，當抗原濃度的增加不

10、再增強信號時，就達到了平衡點。進一步增加抗原的量會導致沉淀物總量減少。當抗原濃度遠遠超過所有抗體結合容量時，就會產(chǎn)生可溶性物質(zhì)，接著互相交聯(lián)形成的沉淀物無法檢測。在抗原過量區(qū)域，所有具有較大病理學濃度范圍的人體蛋白，都受到這種現(xiàn)象的影響。Green等根據(jù)反應曲線的形狀提出了“鉤狀效應(Hook Effect)”的名稱。目前鉤狀效應主要針對抗原過剩而言，我們運用的BN Prospec特種蛋白儀方法學上較其他儀器具有明顯的優(yōu)勢：動態(tài)定時散射

11、比濁、前向全散射的光收集和乳膠增強試劑使靈敏度提高十倍。此外，儀器還具有抗原過剩的自動稀釋檢測功能，間接抗原過量檢測，避免了高劑量Hook效應造成的假陰性結果，檢測的范圍也更寬廣。本研究應用抗原抗體反應原理利用動態(tài)定時散射比濁分析技術監(jiān)測人血清中的免疫球蛋白系統(tǒng)類相關蛋白的含量，以此來評價臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸以及預后。評價該方法的精密度、靈敏度、穩(wěn)定性、正常參考值范圍等指標，并與與Dadebehring公司的同類試劑進行了臨床血清

12、標本檢測結果的相關性比較。結果顯示：(1)進口原裝反應液和稀釋緩沖液與本實驗室研制反應液和稀釋液同樣條件下對30份正常人標本進行對比測定結果相關性好，r=0.991，P<0.01，線性方程為Y(自制試劑)=-0.11+1.012X(德靈試劑)，結果有顯著統(tǒng)計學意義，重復性高，穩(wěn)定性好，37℃條件下一年內(nèi)保存均穩(wěn)定有效。(2)IgA、IgG、IgM研制試劑：最低檢測限分別為0.028 g·L-1、0.72 g·L-1、0.022g·L-1

13、；批內(nèi)精密度2.1％～4.9％、1.6％～3.5％、3.5％～5.0％，批間精密度2.0％～3.1％、3.0％～4.5％、2.6％～4.1％；IgA樣本中的游離血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物濃度分別達到10 g·L-1、600mg·L-1、9.9g·L-1時對檢測結果無顯著性影響，IgG樣本中的游離血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物濃度分別達到10g·L-1、600mg·L-1、19 g·L-1時對檢測結果無顯著性影響，IgM樣本中

14、的游離血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物濃度分別達到10g·L-1、600mg·L-1、4.6g·L-1時對檢測結果無顯著性影響；測定54份臨床血清標本計算與進口同類試劑測得結果顯示兩種試劑相關性好，結果有顯著統(tǒng)計學意義：IgA線性方程為Y(自制試劑)=1.101+0.881X(德靈試劑)，相關系數(shù)為0.980；IgG線性方程為Y(自制試劑)=0.148+0.901X(德靈試劑)，相關系數(shù)為0.979；IgM線性方程為Y(自制試劑)=1

15、.045-0.075X(德靈試劑)，相關系數(shù)為0.967。正常參考值范圍IgA、IgG、IgM分別為0.59～4.31g·L-1、6.9～17.92g·L-1、0.35～2.23g·L-1。(3)補體C3、C4研制試劑：最低檢測限分別為0.022g·L-1、0.0014 g·L-1；批內(nèi)精密度2.0％～4.9％、4.5％～5.0％，批間精密度5.4％～6.8％、3.8％～5.1％；C3樣本中的游離血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物濃度分

16、別達到10 g·L-1、600mg·L-1、5.7g·L-1時對檢測結果無顯著性影響，C4樣本中的游離血紅蛋白、膽紅素、甘油三酯等干擾物濃度分別達到10 g·L-1、600mg·L-1、2.4g·L-1時對檢測結果無顯著性影響；測定54份臨床血清標本計算與進口同類試劑側得結果顯示兩種試劑相關性好，結果有顯著統(tǒng)計學意義：C3線性方程為Y(自制試劑)=-0.245+1.006X(德靈試劑)，相關系數(shù)為0.974；C4線性方程為Y(自制試劑)

17、=1.101+0.993X(德靈試劑)，相關系數(shù)為0.961。正常參考值范圍C3、C4分別為0.90～1.68g·L-1、0.110～0.408g·L-1。(4)穩(wěn)定性；將免疫球蛋白類免疫比濁抗體試劑和標準品于37℃放置7天后，標準品散射光Value值有所下降，但標準曲線良好，檢測范圍無改變，3個陽性血清的測值與放置前接近，批內(nèi)和批間精密度CV仍低于10％。我們的研究結果表明，建立的定時散射比濁分析法測定免疫球蛋白系統(tǒng)IgA、IgG、I