國產(chǎn)多孔鉭對大鼠軟骨細胞生物學(xué)行為及功能變化的體外研究.pdf

1、目的：通過對醫(yī)用多孔鉭支架材料的物理特性、軟骨細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、軟骨功能活性以及細胞因子分泌功能的影響進行研究，探討多孔鉭材料作為軟骨組織工程支架材料修復(fù)軟骨缺損，恢復(fù)軟骨組織的生理結(jié)構(gòu)與功能的可行性，為進一步體內(nèi)實驗以及臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
　　方法：1掃描電鏡觀察多孔鉭材料的形態(tài)特征。取三周 SD大鼠四肢關(guān)節(jié)軟骨細胞進行分離、培養(yǎng)及鑒定；根據(jù)國標(biāo) ISO10993-5/ISO10993-12，以F12培養(yǎng)基為浸提

2、介質(zhì)分別制備多孔鉭材料浸提液和多孔鈦材料浸提液，以不同濃度（100％、50%、25%）多孔鉭浸提液培養(yǎng)的軟骨細胞作為實驗組，多孔鈦浸提液培養(yǎng)和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的軟骨細胞分別作為對照組，通過倒置相差顯微鏡及 MTT法觀察材料浸提液對軟骨細胞生長、增殖的影響，檢測多孔鉭材料的細胞毒性。2多孔鉭材料與軟骨細胞進行體外復(fù)合培養(yǎng)，經(jīng)倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡等觀察軟骨細胞在材料上的形態(tài)、黏附、生長及增殖。3流式細胞儀檢測多孔鉭培養(yǎng)的軟骨細胞

3、的細胞周期及凋亡。4二甲基亞甲基藍比色法定量檢測多孔鉭材料對軟骨細胞合成糖胺多糖的影響。5實時熒光定量 PCR檢測多孔鉭材料對軟骨性細胞因子MMP-13、Aggrecan和II型膠原 mRNA表達的影響。
　　結(jié)果：1多孔鉭形態(tài)特征：多孔鉭外觀灰色、光亮，材料表面及斷面均可見蜂窩狀孔隙，孔隙分布均勻且呈針尖大小。掃描電鏡觀察下多孔鉭材料的微孔直徑約400～600μm（×500），內(nèi)部孔隙約50～200μm（×1000）且相互連通，

4、多孔鉭材料孔隙連通性好且分布較均勻，結(jié)構(gòu)類似于松質(zhì)骨構(gòu)架。2體外細胞毒性檢測：隨著培養(yǎng)時間的延長，各濃度多孔鉭浸提液組、多孔鈦浸提液組及完全培養(yǎng)基組的細胞生長無明顯差異，軟骨細胞形態(tài)均正常，貼壁增殖良好，相同時間點各濃度多孔鉭浸提液組和兩組對照組的細胞增殖活力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3多孔鉭材料與軟骨細胞復(fù)合培養(yǎng)：倒置相差顯微鏡下可見多孔鉭材料的邊緣及培養(yǎng)板底部黏附大量軟骨細胞；掃描電鏡可見軟骨細胞在多孔鉭表面及孔隙內(nèi)能夠良

5、好的黏附、伸展及增殖，細胞形態(tài)多樣，細胞間可相互連接，且能夠正常分泌細胞外基質(zhì)；透射電鏡顯示軟骨細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)大小及形態(tài)均正常，無明顯改變。4軟骨細胞周期及細胞凋亡檢測：多孔鉭培養(yǎng)組及兩組對照組細胞均為正常二倍體細胞，三組細胞周期分布相似；多孔鉭組及對照組的細胞凋亡率及壞死細胞率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。5軟骨細胞糖胺多糖定量檢測：細胞在多孔鉭材料上能夠保持軟骨細胞特異表型，且分泌 GAG。6軟骨細胞分泌功能檢測：實時熒光定

6、量PCR檢測多孔鉭材料對 MMP-13和II型膠原 mRNA的表達與完全培養(yǎng)基對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；Aggrecan mRNA的表達上調(diào)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1軟骨細胞在多孔鉭浸提液中培養(yǎng)生長、增殖狀態(tài)良好，說明多孔鉭材料對軟骨細胞無毒性。2多孔鉭材料與軟骨細胞復(fù)合培養(yǎng)，細胞在其表面與孔隙內(nèi)黏附、生長及增殖良好，能夠保持細胞特異表型且正常分泌糖胺多糖，說明多孔鉭具有良好的生物相容性。3